高效液相色譜技術(shù)檢測(cè)β―地中海貧血的臨床價(jià)值探討-醫(yī)學(xué)論文

β―地中海貧血（β-thalassemia）簡(jiǎn)稱β―地貧，是由于常染色體遺傳性缺陷，導(dǎo)致β―珠蛋白鏈的合成受到抑制或部分抑制而引起的一組嚴(yán)重危害的遺傳性溶血性貧血，常見(jiàn)于地中海，美國(guó)黑人，東南亞，印度次大陸以及中國(guó)地區(qū)，已成為全球性的公共健康問(wèn)題^[1]。在我國(guó)，以長(zhǎng)江以南各省發(fā)病率最高，其中廣西省，廣東省，福建省為β―地中海貧血高發(fā)區(qū)^[2]。目前，基因檢測(cè)是診斷β―地中海貧血的最可靠方法，但由于該實(shí)驗(yàn)技術(shù)要求高，操作繁瑣，價(jià)格昂貴且不易進(jìn)行有效的質(zhì)量控制，故不適合于做大規(guī)模的人群篩查。而目前常規(guī)使用的平均紅細(xì)胞體積（MCV），平均血紅蛋白（MCH），紅細(xì)胞脆性試驗(yàn)，血紅蛋白電泳等篩查方法，雖操作簡(jiǎn)便，成本低廉，但又因其敏感性和特異性較低，人為影響因素較大，誤診和漏診現(xiàn)象較嚴(yán)重等問(wèn)題，近年來(lái)已逐步開(kāi)始被快速、準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)的高效液相色譜法（HPLC）所取代。本文以反向斑點(diǎn)雜交（RDB）方法為金標(biāo)準(zhǔn),使用24條探針,同時(shí)檢測(cè)中國(guó)人群中β―地中海貧血最常見(jiàn)的8個(gè)位點(diǎn)和9個(gè)少見(jiàn)位點(diǎn)突變，對(duì)已確診的128例β―地中海貧血攜帶者及53例正常對(duì)照，回顧性分析其HPLC血紅蛋白分析中的HbA2含量，從而評(píng)價(jià)HPLC法在β―地中海貧血中的診斷價(jià)值。

1資料與方法

1.1資料  2009年1月到2010年6月在我院遺傳門診咨詢的患者 308例，選擇經(jīng)基因診斷證實(shí)為β―地中海貧血的患者128名（患病組）及非β―地中海貧血人群53名（對(duì)照組），年齡1至43周歲，抽取其靜脈血2毫升，EDTA抗凝。

1.2方法

1.2.1 HbA2含量測(cè)定 采用高效液相色譜法（HPLC）進(jìn)行血紅蛋白分析，儀器為美國(guó)BIO-RAD公司VARIANTⅡ全自動(dòng)血紅蛋白分析儀，使用配套試劑及質(zhì)控品，嚴(yán)格按照儀器使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。診斷標(biāo)準(zhǔn)：β―地中海貧血HbA2>4.0%。

1.2.2 β―地中海貧血基因診斷 采用深圳益生堂生物企業(yè)有限公司的β―地中海貧血基因檢測(cè)試劑盒，經(jīng)DNA擴(kuò)增后，用膜反向雜交技術(shù)，使用24條探針，同時(shí)檢測(cè)中國(guó)人群常見(jiàn)的8個(gè)位點(diǎn)：CD41-42（-TCTT），IVS-2-654（C→T），CD17（A→T），-28（A→G），CD26（G→A），CD71-72（+A），CD43（G→T），-29（A→G）和9個(gè)少見(jiàn)位點(diǎn)突變：起始密碼子ATG→AGG，CD14-15（+G），CD27-28（+C），-32（C→A），-30（T→C），IVS-1-1（G→T），IVS-1-5（G→C），CD31（-C），CAP+40—+43（-AAAC）。操作嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.3試驗(yàn)評(píng)價(jià)指標(biāo) 按下列幾個(gè)參數(shù)對(duì)HPLC法在β―地中海貧血中的診斷價(jià)值進(jìn)行評(píng)價(jià)，即靈敏度（Se）= a / (a + c)×100％，特異度（Sp）= d / (b +d)×100％，準(zhǔn)確度（Ac）= (a + d)/ (a +b + c +d)×100％，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值（PPV）= a / (a + b)×100％，陰性預(yù)測(cè)值（NPV）= d / (c +d)×100％。其中a為HPLC法檢測(cè)患病組中的陽(yáng)性數(shù)，b為該法檢測(cè)對(duì)照組中的陽(yáng)性數(shù)，c為該法檢測(cè)患病組中的陰性數(shù)，d為該法檢測(cè)對(duì)照組中的陰性數(shù)。

2 結(jié)果

2.1  128例β―地中海貧血患者和53例對(duì)照中，其HPLC法檢測(cè)結(jié)果詳見(jiàn)表1。

      表1  HPLC法與基因分析法檢測(cè)β地貧結(jié)果比較

                               HPLC法（β地貧）

基因分析

陽(yáng)性                         陰性

陽(yáng)性                  127                          1

陰性                  2                            51

2.2 HPLC法用于β―地中海貧血診斷的臨床價(jià)值評(píng)價(jià)結(jié)果，詳見(jiàn)表2。

                 表2   HPLC法的實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)指標(biāo)

 靈敏度Se  特異度Sp   準(zhǔn)確度Ac  陽(yáng)性預(yù)測(cè)值PPV  陰性預(yù)測(cè)值 NPV

     (%)        (%)        (%)            (%)              (%)

   99.2       96.2        98.3           98.4              98.1

2.3經(jīng)基因檢測(cè)明確診斷的128例β―地中海貧血患者中，基因型分布情況及各基因型所占的比例，詳見(jiàn)表3

表3 β地貧基因型及所占百分比

基因突變類型                  例數(shù)（n）               百分比（%）

IVS-2-654（C→T）             67                      52.3

CD41-42（-TCTT）             37                      28.9

CD17（A→T）                 14                      10.9

-28（A→G）                   7                       5.5

CD27-28（+C）                 1                       0.8

CD43（G→T）                 1                        0.8

CD26（G→A）                 1                          0.8

3討論

β―地中海貧血是世界上最常見(jiàn)和發(fā)病率最高的遺傳性溶血性貧血,也是危害最嚴(yán)重的血紅蛋白病之一^[3]。由于該病至今尚無(wú)有效的治療方法，預(yù)防是最為有效的應(yīng)對(duì)措施，而臨床上有相當(dāng)一部分輕型或靜止型的β―地中海貧血患者沒(méi)有臨床癥狀，但卻攜帶致病基因，并可能將異常基因遺傳給下一代，故如果夫妻雙方均為同一類型基因雜合子時(shí)，后代有四分之一的可能出現(xiàn)重型β―地中海貧血患兒，且此類患兒常在出生后幾個(gè)月就開(kāi)始貧血，臨床癥狀嚴(yán)重，必須依靠長(zhǎng)期輸血以維持生命，對(duì)社會(huì)和家庭都將帶來(lái)沉重的經(jīng)濟(jì)和精神上的負(fù)擔(dān)，所以提倡婚前進(jìn)行β―地中海貧血篩查及對(duì)未進(jìn)行婚檢的孕婦進(jìn)行產(chǎn)前β―地中海貧血篩查顯得尤其重要，對(duì)篩查出的高風(fēng)險(xiǎn)人群進(jìn)行基因診斷，必要時(shí)對(duì)孕婦進(jìn)行羊膜腔或臍靜脈穿刺，抽取羊水或臍血進(jìn)行胎兒產(chǎn)前β―地中海貧血基因診斷，如確診為重癥患兒應(yīng)建議給予引產(chǎn)，從而降低了圍產(chǎn)兒死亡率和出生缺陷兒發(fā)生率，對(duì)提高出生人口素質(zhì)，切實(shí)做好優(yōu)生優(yōu)育工作具有重要意義。

目前，β―地中海貧血非基因檢測(cè)技術(shù)很多，如血常規(guī)，紅細(xì)胞滲透脆性試驗(yàn)等^[4]，此類方法操作要求低，費(fèi)用低廉，但敏感性差，特異性不高，且部分患者M(jìn)CV及紅細(xì)胞滲透脆性試驗(yàn)可以正常，是造成β―地中海貧血基因攜帶者漏診的主要原因，漏診率達(dá)到13.23％^[5]。而近來(lái)廣泛應(yīng)用的血紅蛋白電泳法也存在著準(zhǔn)確性和重復(fù)性不佳的缺點(diǎn)^[6]。故國(guó)際地貧協(xié)會(huì)現(xiàn)已推薦使用高效液相色譜法作為β―地貧常規(guī)篩查方法。HPLC是采用離子交換層析法自動(dòng)快速分析血紅蛋白，此方法分離率高，可以把理化性質(zhì)相差不大的混合物通過(guò)簡(jiǎn)單的分離技術(shù)，使微小差異的各組分通過(guò)幾百次甚至幾千次的重復(fù)累積為大的差異而達(dá)到分離，特別適合于生物大分子如各種血紅蛋白組分的分離。而β―地中海貧血是由于β珠蛋白基因突變使β珠蛋白鏈合成受阻所致，此時(shí)機(jī)體為代償β珠蛋白鏈的減少，而使δ珠蛋白基因的轉(zhuǎn)錄升高，合成增加的δ珠蛋白易與相對(duì)過(guò)剩的α－珠蛋白鏈結(jié)合生成過(guò)多的HbA2。故通過(guò)檢測(cè)血紅蛋白中的HbA2含量，可以達(dá)到篩查β―地中海貧血的目的，若此值高于診斷標(biāo)準(zhǔn)，高度懷疑β―地中海貧血,建議做基因檢測(cè)以進(jìn)一步明確診斷。

在本次研究中，我們對(duì)經(jīng)基因確診的β―地中海貧血患者128例，及正常對(duì)照53名進(jìn)行回顧性分析，從實(shí)驗(yàn)靈敏度，特異度，準(zhǔn)確度，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值等方面對(duì)HPLC法進(jìn)行了一個(gè)全面系統(tǒng)的評(píng)價(jià)，證實(shí)了HPLC的確為β―地中海貧血介于篩查與診斷之間的一個(gè)比較理想的方法。此外，對(duì)于研究中出現(xiàn)的一例β―地中海貧血基因攜帶者，其HPLC法測(cè)得的HbA2雖正常，但檢測(cè)中其HbF及血紅蛋白出峰圖譜均提示可能同時(shí)攜帶α―地貧，于是對(duì)其進(jìn)行了α―地貧基因檢測(cè)，果然得到證實(shí)，故考慮該患者同時(shí)攜帶兩種地貧基因，由于α、β珠蛋白生成都減少，導(dǎo)致HbA2正常甚至可能偏低，從而掩蓋了β―地中海貧血HbA2增高的現(xiàn)象。與此相反，當(dāng)出現(xiàn)HPLC法陽(yáng)性，而常規(guī)基因位點(diǎn)分析未檢出突變的現(xiàn)象時(shí)，應(yīng)考慮兩種可能存在，一是HPLC法檢測(cè)HbA2時(shí)，血紅蛋白D和E在HbA2被洗脫的同時(shí)也一起被洗脫下來(lái)，此外成分很少的HbS和其他類型的血紅蛋白也可與HbA2一同被洗脫，造成HbA2假性升高，但此種現(xiàn)象較少出現(xiàn)。二要結(jié)合臨床表現(xiàn)及其他實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果，對(duì)高度懷疑為β―地中海貧血的患者應(yīng)考慮是否存在罕見(jiàn)的基因突變類型未在所檢測(cè)的基因位點(diǎn)之列，以防出現(xiàn)漏檢現(xiàn)象。在此次研究中，我們就對(duì)HPLC法陽(yáng)性而常規(guī)基因分析陰性的其中一個(gè)標(biāo)本進(jìn)行了更深一步的研究剖析，最后明確其為一種國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道的新型β―地中海貧血基因突變類型，突變位點(diǎn)為Codon36(- C)，這也證實(shí)了在做常規(guī)基因分型的同時(shí)，用HPLC法進(jìn)行血紅蛋白分析的重要性，它可充分彌補(bǔ)常規(guī)基因檢測(cè)類型較少的不足。此外，HPLC技術(shù)還可準(zhǔn)確分析HbF，以及HbS等異常血紅蛋白帶^[7]，甚至能分離出血紅蛋白電泳所無(wú)法區(qū)分的條帶，且受人為因素影響小，實(shí)驗(yàn)方便快速，費(fèi)用低廉，檢測(cè)通量大，完全可以取代其他篩查方法用于臨床中β―地中海貧血的輔助診斷，尤其適用于大規(guī)模的人群篩查。

4 參考文獻(xiàn)

1 Vichin sky EP. Changing pattems of thalassemia worldwide[J]. Ann N Y Acad Sci,2005,1054(1):18-24.

2杜傳書(shū). 地中海貧血研究的現(xiàn)狀與未來(lái)[J].中華醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)雜志,1996,13(5):257

3鄭美琴，李偉，呂建新. 溫州地區(qū)漢族人群β―地中海貧血患者β珠蛋白基因突變分析[J].中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,2010,33(3):236

4覃西，毛煒，吳潔等. 非基因法檢測(cè)地中海貧血現(xiàn)狀[J].中國(guó)優(yōu)生與遺傳雜志,2007,15(3):122-124

5朱學(xué)海，魏代奎.地中海貧血的基因診斷分析[J].中國(guó)實(shí)用醫(yī)藥,2008,3(13):126-127

6 Colah RB, SurveR, Sawant P, et al. HPLC studies in hemoglobinopathies [J] .Indian Pediatr,2007,74(7):657-662

7 Wajcman H. Diagnosis and screening of sickle cell disease [J]. Rev Prat,2004,54(14):1543-1547