肢體缺血動物模型研究進(jìn)展-醫(yī)學(xué)論文

1模型制作

　　1.1暫時缺血模型

　暫時缺血模型包括肢體缺血再灌注損傷模型[3]以及缺血預(yù)處理模型，適用于肢體缺血再灌注損傷的防治[4]、肢體遠(yuǎn)距缺血預(yù)處理[5]和肢體遠(yuǎn)距缺血后適應(yīng)[6]的研究。暫時缺血模型制作方法分為肢體環(huán)扎法和暫時阻斷動脈法兩種。肢體環(huán)扎法是外用繃帶、止血帶或橡皮筋等物質(zhì)環(huán)扎于動物單側(cè)或雙側(cè)肢體根部[4，7]，一段時間后放開，以此達(dá)到暫時缺血的目的。環(huán)扎時間視研究目的而異，缺血再灌注損傷一般為4h左右，而肢體缺血后適應(yīng)或肢體遠(yuǎn)距預(yù)處理多為5min，并反復(fù)多次進(jìn)行。肢體環(huán)扎法具有無創(chuàng)性，對實(shí)驗(yàn)動物的損傷較小。暫時阻斷動脈法通過手術(shù)分離實(shí)驗(yàn)動物某側(cè)局部供血動脈，用血管夾暫時夾閉血流，最少3h后撤夾恢復(fù)血流灌注，其效果比肢體環(huán)扎法可靠，但對實(shí)驗(yàn)動物的損傷較大[8]。Messina等[2]將兩種方法相結(jié)合使用，以加強(qiáng)肢體的急性缺血程度，其效果較單純環(huán)扎或單純夾閉血管要好。大體上看，暫時缺血模型的建立方法簡便、易行，效果能夠令人滿意，基本上可以符合實(shí)驗(yàn)要求。

　　1.2永久缺血模型

　　永久缺血模型是目前國內(nèi)外肢體急、慢性缺血模型的主流，在缺血損傷、血管新生、細(xì)胞移植及基因轉(zhuǎn)染等方面研究應(yīng)用最為廣泛[9-11]，其制作方法繁多，主要有血管結(jié)扎切斷法和血管栓塞法等。

　　1.2.1血管結(jié)扎切斷法血管結(jié)扎切斷法在暫時阻斷動脈法基礎(chǔ)上，將分離出的某支供血動、靜脈主干或其分支進(jìn)行結(jié)扎或切斷以造成急性血管永久阻斷從而引起缺血，為國內(nèi)外肢體缺血模型中最常用的制作方法。根據(jù)阻斷方式和阻斷血管的不同又可細(xì)分為單純結(jié)扎血管、結(jié)扎并切斷血管、動靜脈雙阻斷和單純動脈阻斷幾種類型。單純結(jié)扎血管法主要用于構(gòu)建缺血時間不超過2周的急性缺血模型。而結(jié)扎并切斷血管法比單純結(jié)扎血管所產(chǎn)生的缺血現(xiàn)象嚴(yán)重，缺血時間長達(dá)4周左右，甚至Luo等[12]通過2次手術(shù)造成實(shí)驗(yàn)動物更為嚴(yán)重的缺血，持久時間約60d，適用于慢性持續(xù)性肢體缺血模型的建立。動靜脈雙結(jié)扎切斷雖可造成較嚴(yán)重的缺血損傷，但其引起的病理改變與外周動脈疾病存在較大差異[13]，目前主要用于缺血模型影響因素方面的研究。而單純動脈結(jié)扎切斷因其所引起的血流變化與臨床外周動脈疾病相似而被廣泛應(yīng)用[13]，備選切斷的血管有股動脈[14]、股動脈及其分支[15]、髂總動脈[16]以及髂、股動脈及其分支[17-18]等，所引起的缺血損傷程度大體上依該次序遞增。不同學(xué)者因采用的實(shí)驗(yàn)動物品種不同，選擇結(jié)扎切斷的動脈也不盡相同，單純切斷股動脈或髂總動脈一般用于下肢血管非常細(xì)的大鼠等小型動物；結(jié)扎切斷髂股段動脈及其分支，可用于犬、兔等大型動物及小鼠、大鼠等小型動物的造模[18-20]。若實(shí)驗(yàn)動物下肢血管豐富，如小鼠解剖上雖然缺乏股深動脈，但髂股段存在大量側(cè)支血管，則需同時切斷髂股段的主要分支以防止側(cè)支血流的快速重建[20]。以此類推，結(jié)扎并切斷髂股段動脈及其分支為最普遍采用的永久缺血模型造模方法。

　　1.2.2血管栓塞法血管栓塞法采用外周性血管栓塞劑注入實(shí)驗(yàn)動物下肢供血動脈引起血管栓塞進(jìn)而產(chǎn)生缺血。不同栓塞劑栓塞效果不一。碘化油和明膠海綿屬于短期血管栓塞劑，不僅無法栓塞微血管網(wǎng)，且Kobayshi等[21]報(bào)道稱，增加栓塞次數(shù)，會導(dǎo)致組織缺氧引起血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）及Bcl-2蛋白過量表達(dá)，加速形成側(cè)支循環(huán)而降低栓塞效果，缺血持續(xù)時間約1周，無法滿足慢性缺血的特性。而白及膠因其直徑小至3.5mm，可栓塞末梢小動脈，維持時間長達(dá)5周，隨后被降解吸收，可允許重復(fù)栓塞治療。而且堵塞在較大口徑血管內(nèi)的白及膠在血流的沖擊和溶解下，產(chǎn)生“遷徙”現(xiàn)象，到達(dá)更細(xì)的分支內(nèi)造成更均勻、徹底的栓塞，同時，白及可抑制革蘭陽性菌而減少被栓塞器官的感染[22]。為進(jìn)一步提高栓塞效果，可將白及膠進(jìn)行乳化、凍凝、化學(xué)交聯(lián)后制備出白及膠微球，其不僅具有白及膠的特性，還能在血液中緩慢膨脹機(jī)械性阻塞血管，粗糙的表面可促使血小板解體，導(dǎo)致繼發(fā)性血栓形成，并可持續(xù)至少一個月不被溶解。因白及膠微球直徑僅為幾十微米，能更均勻、徹底地栓塞后肢小血管分支，達(dá)到完全性栓塞的效果，栓塞作用時間持久，效果穩(wěn)定，重復(fù)性好，是一種理想的肢體缺血模型制作方法[23]。目前國內(nèi)學(xué)者多將其應(yīng)用于大鼠慢性肢體缺血模型的制作，國外還未見相關(guān)報(bào)道。

1.2.3其他方法采用不同手段使動脈管腔縮窄或閉塞，適用于犬、兔等大型動物造模。馬中等[24]、邊杰芳等[25]通過結(jié)扎包括股深動脈在內(nèi)的所有分支，縱形切開股動脈前壁0.5cm，自切開處向動脈腔遠(yuǎn)端并列插入2根長25~30cm，直徑1.5mm的螺旋狀金屬絲，插入后以無創(chuàng)血管縫線縫合動脈切口，并使股動脈管腔縮窄約1/2，逐層縫合皮下組織及皮膚的方法制作犬后肢缺血模型。其原理是通過置入的異物使血管內(nèi)皮受損，膠原成分暴露，激活外源性凝血機(jī)制，逐漸形成管腔內(nèi)血栓；同時金屬絲的機(jī)械栓堵人為將股動脈管腔縮窄約1/2，迫使動脈血流銳減，側(cè)支代償相對不足，而造成顯著的肢體慢性缺血癥狀。Grigorios等[26]通過將3-F導(dǎo)管插入新西蘭大白兔左股淺動脈，并置入5個鉑金線圈的方法使動物血管閉塞，成功制作肢體缺血模型。另外，Gale等[27]報(bào)道一種含有吸濕性酪蛋白的縮窄器，可吸收血管腔內(nèi)水分并逐漸膨脹，進(jìn)而阻塞整個血管腔，亦可用于制作慢性下肢缺血動物模型。

　　2模型評價

　　2.1暫時缺血模型

　　骨骼肌缺血損傷是一個多因素參與的復(fù)雜過程，目前主要圍繞下述幾方面機(jī)制的指標(biāo)對模型進(jìn)行相應(yīng)評估：①能量代謝障礙。當(dāng)組織缺血時，有氧代謝途徑受阻而變?yōu)闊o氧代謝，乳酸、乳酸鹽大量增加對細(xì)胞造成損害，細(xì)胞膜完整性破壞，細(xì)胞內(nèi)酶及蛋白質(zhì)外漏，而致血中肌酸磷酸激酶和乳酸脫氫酶的含量明顯升高[4]。②氧自由基損傷。肢體缺血或再灌注時，肌體產(chǎn)生大量氧自由基使組織內(nèi)過多消耗超氧化物歧化酶（SOD），同時不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化形成丙二醛（MDA）不斷損傷組織，并引起鈣超載，進(jìn)一步加重組織的損傷，故血清和骨骼肌SOD、MDA含量可反映組織氧自由基含量及氧化損傷程度[4]。③骨骼肌鈣離子超載和黃嘌呤氧化酶（XOD）[28]水平。骨骼肌缺血和再灌注后不斷產(chǎn)生的氧自由基損傷了細(xì)胞膜和線粒體膜，使Ca2+-ATP酶活性不斷降低，不能將胞內(nèi)的Ca2+泵出胞外，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的Ca2+濃度明顯增加；同時，再灌注時鈣離子交換受阻，線粒體及溶酶體內(nèi)Ca2+濃度升高，Ca2+與胞漿受體鈣調(diào)蛋白結(jié)合后，激活蛋白酶，使黃嘌呤脫氫酶轉(zhuǎn)變?yōu)閄OD而大量堆積。④炎癥反應(yīng)。血清髓過氧化物酶（MPO）是中性粒細(xì)胞的標(biāo)志酶，可反映中性粒細(xì)胞聚積的程度，下肢腓腸肌病理學(xué)檢測可觀察中性粒細(xì)胞的浸潤情況[4]，通過檢測MPO含量及骨骼肌病理學(xué)觀察以明確炎癥反應(yīng)的程度。⑤血管內(nèi)皮損傷。其可通過腓腸肌濕重干重比測定[4]和病理學(xué)觀察加以確定。前者反映骨骼肌組織水腫程度，與再灌注損傷時組織微血管床損傷有關(guān)；后者可直觀形象地反映肢體骨骼肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷情況。此外，結(jié)合機(jī)體骨骼肌缺血損傷的臨床綜合表現(xiàn)，還需進(jìn)行肢體顏色、皮溫、活動狀態(tài)等一般狀態(tài)觀察[16]。

　　2.2永久缺血模型

　　要想建立與嚴(yán)重慢性肢體缺血患者具有相似性的動物模型，必須利用現(xiàn)有的技術(shù)手段，其中，微血管密度為判斷側(cè)支循環(huán)生成的“金標(biāo)準(zhǔn)”[29]，血管造影和血流灌注測定是必備的監(jiān)測方法，從而客觀、具體地評價缺血的程度和時間。國內(nèi)外學(xué)者普遍以健側(cè)肢體作為對照，從形態(tài)和功能兩方面同時對下肢永久缺血模型進(jìn)行評價[30]。①形態(tài)方面：通過各種血管造影等技術(shù)手段分析后肢側(cè)支血管數(shù)和微血管密度，最常用的血管造影術(shù)為動脈注射數(shù)字減影法[15]，但其空間分辨率不高，細(xì)小血管顯示欠清晰，可采用CT血管造影[30]更逼真地顯示血管立體形態(tài)及其與周圍結(jié)構(gòu)關(guān)系。除此以外，還可結(jié)合病理形態(tài)學(xué)觀察缺血組織結(jié)構(gòu)進(jìn)行多方面評價模型缺血效果。②功能方面：采用功能等級評分表[31]（目前已形成的有鼠后肢缺血等級評分標(biāo)準(zhǔn)表[32]）結(jié)合動物缺血損傷的一般臨床表現(xiàn)對肢體功能進(jìn)行評價，并使用激光多普勒灌注系統(tǒng)[17]測定下肢血流量、血壓和皮溫評價肢體血流灌注情況。近年越來越多的先進(jìn)技術(shù)被應(yīng)用于側(cè)支循環(huán)功能的評價，并各具特點(diǎn)，其中，放射性同位素灌注掃描簡便易行，能準(zhǔn)確地定量、定位，但顯影所需時間較長[20]；CT灌注成像能快速、無創(chuàng)、定量或半定量地反映組織血管生成及血流灌注，較準(zhǔn)確地評估動物后肢缺血模型隨時間推移發(fā)生的肌肉組織灌注變化，但存在運(yùn)動偽影、溶劑效應(yīng)等問題[29]；核磁共振成像不需注射造影劑，是一種非介入探測技術(shù)，但掃描時間長，空間分辨率不及CT，且價格較昂貴。

　　3問題及展望

　　鑒于肢體缺血動物模型的制備方法、實(shí)驗(yàn)條件控制等方面都取得了很大進(jìn)展，且CT、核磁共振成像等新技術(shù)在模型評價中的推廣應(yīng)用，很大程度促進(jìn)了肢體缺血模型的研究。但還有一些突出問題尚待解決，主要體現(xiàn)在永久缺血模型的穩(wěn)定性和擬人性方面欠佳。由于實(shí)驗(yàn)動物具有極強(qiáng)的血管重建能力，并且急性缺血后局部產(chǎn)生的剪切力、炎性反應(yīng)、內(nèi)皮祖細(xì)胞的局部浸入以及動物豐富的側(cè)支循環(huán)，使患肢能在短時間內(nèi)促進(jìn)血管新生，進(jìn)而恢復(fù)血流。許多研究發(fā)現(xiàn)，即使結(jié)扎并切斷實(shí)驗(yàn)動物后肢供血動脈，引起遠(yuǎn)端肢體缺血壞死的情況并不持久[16，28]，且不同的造模方法導(dǎo)致的缺血程度和持續(xù)時間差異較大，使得模型的穩(wěn)定性急待進(jìn)一步提高。另外，雙側(cè)下肢缺血造模死亡率高[20]，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)動物一般為單側(cè)造模，患肢由初期急性嚴(yán)重缺血可逐漸恢復(fù)到穩(wěn)定的輕度缺血狀態(tài)，而人的下肢慢性缺血往往發(fā)生在雙側(cè)，是一個緩慢的逐漸加重的過程。因此，如何建立一個擬人性較好、可行性高、重復(fù)性好的動物慢性肢體缺血模型仍有待進(jìn)一步探索研究。可喜的是已有學(xué)者開始對不同年齡[31]、不同品系[33]、不同性別[34]以及不同缺血效果[27]的動物模型特點(diǎn)進(jìn)行比較研究，為關(guān)鍵問題的解決提供了基本條件。同時，隨著不同實(shí)驗(yàn)方法的整合和各種新技術(shù)的發(fā)明應(yīng)用，必將進(jìn)一步推進(jìn)肢體缺血模型制作體系的完善。