基于工程化細(xì)菌的活性生物材料研究及其醫(yī)學(xué)應(yīng)用

近年來，面向生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的重大需求，越來越多的研究人員利用天然來源的細(xì)胞、細(xì)菌等活性高分子材料進(jìn)行生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用，在許多疾病的診斷和治療上顯示出巨大潛力. 隨著化學(xué)生物技術(shù)的發(fā)展，研究人員開始聚焦于開發(fā)基于細(xì)菌及其衍生物的疾病診療體系[1,2]. 許多細(xì)菌在研究中顯示出了優(yōu)越的治療特性，例如沙門氏菌的腫瘤靶向能力和抗腫瘤活性[3,4]、乳酸桿菌調(diào)節(jié)腸道菌群平衡的能力[5,6]以及枯草芽孢桿菌的顯著抗菌活性[7,8]等. 盡管細(xì)菌的這些特性在疾病診斷治療中顯示出了廣闊的應(yīng)用前景，但細(xì)菌的高致病性和免疫原性可能會導(dǎo)致其在醫(yī)學(xué)應(yīng)用中產(chǎn)生副作用[9]. 例如：細(xì)菌的強(qiáng)免疫原性可能導(dǎo)致其在體內(nèi)循環(huán)中被快速清除，并存在誘發(fā)免疫系統(tǒng)疾病的風(fēng)險(xiǎn)[10]；細(xì)菌的殺傷效果對正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞均有損傷，這有可能導(dǎo)致正常組織產(chǎn)生嚴(yán)重不良反應(yīng). 這些缺點(diǎn)極大限制了細(xì)菌療法的臨床應(yīng)用. 另外一方面，細(xì)菌在遞送過程中遇到的生物學(xué)挑戰(zhàn)也限制了細(xì)菌遞送技術(shù)的臨床轉(zhuǎn)化. 胃內(nèi)的強(qiáng)酸環(huán)境不利于細(xì)菌的存活[11]，胃腸道的快速運(yùn)輸縮短了益生菌在腸道上的保留時(shí)間，限制了細(xì)菌的黏附與生長[12]，部分細(xì)菌制劑在遞送過程中還存在細(xì)菌泄露的風(fēng)險(xiǎn). 因此，找到“揚(yáng)長避短”的方法以發(fā)揮細(xì)菌的優(yōu)越特性是細(xì)菌療法的關(guān)鍵. 為了提高細(xì)菌的診斷治療效果并降低其副作用，研究人員嘗試通過人工手段對目標(biāo)細(xì)菌進(jìn)行改造. 近年來，隨著跨學(xué)科研究的發(fā)展，研究人員將微生物研究整合到生物學(xué)、化學(xué)、工程學(xué)和材料科學(xué)等領(lǐng)域，基于細(xì)菌的活性生物材料研究便應(yīng)運(yùn)而生[13~16]. 通過物理、化學(xué)技術(shù)和基因工程編輯對細(xì)菌進(jìn)行改造，尤其是對細(xì)菌單個細(xì)胞的修飾和封裝，可以維持細(xì)菌的生存和繁殖能力、精準(zhǔn)定植并獲得更高的生物安全性，這也為細(xì)菌療法開辟了一個全新的領(lǐng)域[17,18].

本文系統(tǒng)總結(jié)了基于物理、化學(xué)修飾和基因工程編輯的工程化細(xì)菌在疾病診斷和治療方面的研究進(jìn)展，包括生物成像、疾病治療以及組織修復(fù)與再生等(圖1)，并介紹了工程化細(xì)菌的臨床研究進(jìn)展. 此外，本文還進(jìn)一步討論了工程化細(xì)菌在醫(yī)學(xué)應(yīng)用上的優(yōu)缺點(diǎn).

Fig. 1  Schematic illustration of engineered bacteria system decorated with physicochemical and bioengineered strategies for disease diagnosis and treatment.

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1 工程化細(xì)菌的構(gòu)建

細(xì)菌工程化一般是根據(jù)細(xì)菌的表面結(jié)構(gòu)與特征，通過物理、化學(xué)技術(shù)和基因工程編輯對細(xì)菌的細(xì)胞膜進(jìn)行改性. 該領(lǐng)域的研究大多集中于細(xì)菌表面的電荷狀態(tài)、化學(xué)基團(tuán)、抗原和蛋白質(zhì)，通過靜電吸附、形成官能團(tuán)、疏水相互作用、目標(biāo)基因的靶向修飾等手段對細(xì)菌進(jìn)行多樣化的改造，從而充分發(fā)揮細(xì)菌的優(yōu)越特性并賦予其新的功能.

1.1 物理與化學(xué)修飾

細(xì)菌細(xì)胞壁中的磷壁酸含有大量強(qiáng)酸性的磷酸基團(tuán)，而大多數(shù)細(xì)菌的細(xì)胞膜帶負(fù)電荷，因此通過在材料中加入陽離子聚合物或進(jìn)行質(zhì)子化處理使其帶正電，便可經(jīng)靜電相互作用將聚合物吸附在細(xì)菌表面，從而為細(xì)菌改性提供了一種可行方案[19]. Wang等先用帶正電荷的陽離子聚合物修飾減毒沙門氏菌，修飾后的細(xì)菌不僅可抓取并攜帶抗原，還可進(jìn)一步將瘤內(nèi)抗原轉(zhuǎn)移至腫瘤邊緣，從而增強(qiáng)抗腫瘤免疫響應(yīng)[20]. Zhao等將含銀量子點(diǎn)通過靜電相互作用加載到雙歧桿菌上，修飾的細(xì)菌可穿透腫瘤組織并逆轉(zhuǎn)免疫抑制腫瘤微環(huán)境，抑制原位乳腺癌腫瘤的生長[21]. Wei等通過靜電作用將包封抗腫瘤藥物的聚乳酸-乙醇酸的納米顆粒修飾在大腸桿菌表面，達(dá)到激活抗腫瘤免疫的效果[22]. Cao等通過靜電作用在大腸桿菌的表面修飾了一層由二油酰磷酸和膽固醇自組裝的脂質(zhì)膜，涂膜的細(xì)菌生存率得到明顯改善，可以免受胃酸環(huán)境刺激，為益生菌的口服治療疾病提供了可行途徑[23].

細(xì)菌的表面帶有特定的化學(xué)基團(tuán)氨基，可分別與羧基、醛基生成酰胺鍵、亞胺鍵. 因此，選擇帶有羧基、醛基的功能性材料，通過生成化學(xué)鍵結(jié)合在細(xì)菌表面，可實(shí)現(xiàn)細(xì)菌的表面化學(xué)修飾[24,25]. Cai等采用超聲乳化法合成表面帶有羧基的光敏劑，通過形成酰胺鍵結(jié)合在鼠傷寒沙門氏菌表面，利用細(xì)菌的厭氧靶向能力將光敏劑遞送到腫瘤的缺氧區(qū)域. 光熱處理后的細(xì)菌可以殺傷腫瘤細(xì)胞，同時(shí)清除腫瘤和瘤內(nèi)細(xì)菌[26]. Chen等合成了負(fù)載光敏劑亞甲基藍(lán)(MB)的結(jié)晶沸石咪唑酸鹽框架(ZIF-90@MB) (圖2(a))，通過ZIF的醛基可將光敏劑修飾在表面沉積鈀納米顆粒的希瓦氏菌MR-1上(圖2(b)). 修飾的希瓦氏菌通過厭氧靶向性到達(dá)腫瘤部位后，在腫瘤的酸性環(huán)境下，細(xì)菌與帶醛基的材料形成的亞胺鍵會發(fā)生水解，從細(xì)菌表面脫落的光敏劑在光照下釋放單線態(tài)氧破壞線粒體，使其ATP合成受阻，下調(diào)了熱休克蛋白(HSP70和HSP90)的表達(dá)，最終影響腫瘤細(xì)胞的耐高溫性. 另一方面，細(xì)菌表面沉積的鈀吸收近紅外光產(chǎn)生熱量，殺死腫瘤細(xì)胞(圖2(c))[27]. 這兩項(xiàng)研究都提出了一種細(xì)菌介導(dǎo)的厭氧靶向策略，用于診斷和根除深部或晚期實(shí)體瘤.

Fig. 2  (a) Synthetic procedure of ZIF-90/MB; (b) Synthetic procedure of engineered Shewanella oneidensi; (c) Mechanism of tumor targeting and photothermal tumor ablation of PTB@ZIF-90/MB upon laser irradiation (Reprinted with permission from Ref.?[27]; Copyright (2020) Wiley-VCH GmbH).

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一些細(xì)菌通過自發(fā)氧化還原反應(yīng)靶向環(huán)境中的金屬離子，并通過生物酶促反應(yīng)將其轉(zhuǎn)化為金屬元素，這種生物礦化反應(yīng)也常用于細(xì)菌的化學(xué)修飾，且不會影響細(xì)菌的生存能力[28,29]. Fan等對大腸桿菌MG 1655進(jìn)行了雙重修飾：先對細(xì)菌進(jìn)行轉(zhuǎn)染使其表達(dá)質(zhì)粒治療性蛋白腫瘤壞死因子-α (TNF-α)，接著通過生物礦化反應(yīng)對細(xì)菌表面修飾上光熱轉(zhuǎn)化材料金納米顆粒. 編程的大腸桿菌經(jīng)口服后被轉(zhuǎn)運(yùn)到內(nèi)部微循環(huán)中，靶向腫瘤區(qū)域并快速定植. 經(jīng)光熱處理后誘導(dǎo)TNF-α的表達(dá)，最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡[30]. 此外，有研究把金屬有機(jī)骨架(MOF)與細(xì)菌相結(jié)合以構(gòu)建自驅(qū)動生物反應(yīng)器. Wang等先用生物相容性的聚烯丙胺鹽酸鹽修飾非致病性希瓦氏菌，使細(xì)菌表面帶正電荷，然后用透明質(zhì)酸包裹負(fù)載抗癌藥物阿霉素的MOF. 帶正電的希瓦氏菌與帶負(fù)電的MOF通過靜電相互作用，構(gòu)建了一種基于細(xì)菌-MOF生物雜交的自驅(qū)動生物反應(yīng)器(SO@MDH) (圖3(a))，經(jīng)主動靶向后定植在腫瘤區(qū)域內(nèi)，同時(shí)進(jìn)一步通過乳酸代謝促進(jìn)化療，從而抑制腫瘤生長(圖3(b)) [31].

Fig. 3  (a) Synthesis of the self-driven bioreactor SO@MDH biohybrid; (b) The effect of cyclic lactate catabolism-mediated metabolic therapy (Reprinted with permission from Ref.[31]; Copyright (2021) American Chemical Society).

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細(xì)菌外膜是一層特殊的脂質(zhì)雙分子層，因而可以通過疏水相互作用在細(xì)菌表面修飾生物活性高分子材料. 其中，聚乙二醇共軛磷脂和含膽固醇的疏水烷基鏈?zhǔn)浅Ｓ玫膬捎H性聚合物. 在與細(xì)菌接觸后，其疏水端的烷基鏈可以通過疏水相互作用自發(fā)錨定在細(xì)菌的外膜中[32,33]. Jia等通過將陰離子光敏劑原卟啉與膽固醇修飾的聚乙二醇聚合物連接得到兩親性聚合物Chol-PEG-PpIX. 聚合物中的膽固醇部分極大地促進(jìn)了原卟啉在細(xì)菌表面的富集，實(shí)現(xiàn)光調(diào)節(jié)以破壞細(xì)菌外膜通透性，最終導(dǎo)致細(xì)菌死亡[34]. 由于細(xì)菌表面被帶負(fù)電荷的脂質(zhì)雙層膜包裹，因此可以利用靜電和疏水雙重作用來對細(xì)菌進(jìn)行表面修飾. 代表性的研究是Wang等開發(fā)了一種具有“多合一”性質(zhì)的“智能”試劑. 該試劑主要以乙二醇?xì)ぞ厶菫橹麈?，同時(shí)共軛上熒光標(biāo)記的聚乙二醇-膽固醇兩親性聚合物. 通過膽固醇部分和細(xì)菌膜之間的疏水相互作用，以及帶正電的乙二醇?xì)ぞ厶桥c帶負(fù)電的細(xì)菌膜靜電相互作用，試劑可以廣泛用于染色所有哺乳動物、真菌和細(xì)菌的細(xì)胞[35].

1.2 生物工程改造

隨著合成生物學(xué)與微生物學(xué)的學(xué)科交叉融合與發(fā)展，細(xì)菌在生物醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用取得了顯著成效. 不同于物理、化學(xué)方法修飾策略，生物工程技術(shù)修飾的細(xì)菌的生物相容性和安全性更高. 在本節(jié)中，我們將討論幾種應(yīng)用于細(xì)菌或細(xì)菌衍生物的新興生物工程策略.

基因工程技術(shù)是對生物體基因組的特定目標(biāo)基因進(jìn)行修飾，因此，該技術(shù)兼具可操作性與可設(shè)計(jì)性. 通過基因工程對細(xì)菌進(jìn)行改造，使其表達(dá)靶向、黏附、釋放特定物質(zhì)等不同的功能，可實(shí)現(xiàn)更廣泛的生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用[36]. Joshi課題組開發(fā)了一種活性生物材料療法，具體來說是對大腸桿菌 Nissle菌株進(jìn)行編程，使其產(chǎn)生納米纖維. 經(jīng)口服后，被改造的細(xì)菌會靶向上皮的黏膜層，并與胃腸道黏液結(jié)合填充發(fā)炎區(qū)域，保護(hù)其免受腸道微生物和環(huán)境因素的影響. 這種基于益生菌原位產(chǎn)生治療性蛋白質(zhì)基質(zhì)的研究為胃腸道疾病開發(fā)了一個治療平臺[37]. Harimoto等開發(fā)了一種可遺傳編碼的微生物封裝系統(tǒng). 該系統(tǒng)首先設(shè)計(jì)了一種新的莢膜多糖系統(tǒng)iCAP，通過調(diào)控iCAP系統(tǒng)對大腸桿菌Nissle 1917表面進(jìn)行編程以賦予動態(tài)化功能，控制細(xì)菌在人體血液中存活的時(shí)間. 在小鼠腫瘤模型中經(jīng)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，這種動態(tài)遞送策略使細(xì)菌的最大耐受劑量增加了10倍，并成功殺死了體內(nèi)癌細(xì)胞[38]. Pan等使用大腸桿菌MG1655，通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞溶解素A (ClyA)，接著對工程大腸桿菌表面進(jìn)行化學(xué)修飾上放射增敏劑(圖4(a))，隨著靶向腫瘤后過表達(dá)ClyA調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞周期，最終實(shí)現(xiàn)聯(lián)合放射增敏殺傷乳腺癌(圖4(b))[39].

Fig. 4  (a) Synthesis of the bacteria-mediated nanosystem for radiotherapy-sensitizing effect; (b) Mechanism toward breast carcinoma (Reprinted with permission from Ref.[39]; Copyright (2022) American Chemical Society).

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考慮到細(xì)菌的強(qiáng)免疫原性會導(dǎo)致其被免疫系統(tǒng)清除，目前有研究報(bào)道利用天然細(xì)胞膜對細(xì)菌進(jìn)行封裝，可以保護(hù)細(xì)菌逃脫免疫攻擊并增強(qiáng)細(xì)菌的治療效果[40]. 基于紅細(xì)胞膜的低免疫原性和長循環(huán)特性，Cao等采用機(jī)械擠出技術(shù)制備出紅細(xì)胞膜包裹大腸桿菌Nissle 1917，進(jìn)而生成隱形細(xì)菌(CMCB)，CMCB可以維持細(xì)菌固有的生物活性與增殖能力. 與未包膜的細(xì)菌相比，注射CMCB的安全性更高、治療效果更好. 同時(shí)，其在正常器官的積累量較低，可改善細(xì)菌在疾病部位的定植能力[41]. 該策略可為其他類型的細(xì)胞膜包被益生菌的研究提供強(qiáng)有力的支撐. 此外，紅細(xì)胞可通過生物素-親和素(Biotin-Streptavidin)的高親和能力與細(xì)菌結(jié)合成復(fù)合物. Alapan等利用紅細(xì)胞吸附載有抗癌藥物阿霉素分子和超順磁性氧化鐵的納米顆粒，再與大腸桿菌MG1655結(jié)合制備多功能生物混合微游泳器，這種研究策略可實(shí)現(xiàn)針對性的藥物遞送[42]. 作者同時(shí)提出，紅細(xì)胞作為生物混合微生物中的自體載體，其在穩(wěn)定性、變形性、生物相容性和生物降解性等方面均優(yōu)于合成載體材料. 無論是膜包衣還是結(jié)合方法，都為生物混合細(xì)菌的遞送系統(tǒng)提供了一種有前途的組合策略.

細(xì)菌生物膜具有物理黏附和化學(xué)屏障的雙重功能，利用生物膜包裹細(xì)菌可以保護(hù)細(xì)菌免受物理刺激. Wang等用生物膜包被枯草芽孢桿菌，顯著提高了口服利用度，提高細(xì)菌對胃腸道的抵抗力和黏附性[43]. 細(xì)菌外膜囊泡(OMV)是革蘭氏陰性細(xì)菌釋放的脂質(zhì)雙層外膜囊泡. 作為納米級的球形載體，OMV的直徑范圍為50~250 nm，并含有細(xì)菌的多種成分，包括脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、肽聚糖和核酸等. OMV具有免疫刺激能力，易于修飾且可負(fù)載藥物，因而被廣泛應(yīng)用于疫苗和生物治療藥物的研究[44~46]. 同時(shí)，OMV還繼承了母體細(xì)菌的腫瘤組織的趨向性，可作為靶向腫瘤治療的理想載體[47]. 基于此，Pan 等提取可表達(dá)靶向多肽LyP1的大腸桿菌外膜囊泡(LOMV)，并用LOMV包封阻斷免疫檢查點(diǎn)程序性死亡-1 (PD-1)質(zhì)粒以得到LOMV@PD-1，通過靜脈注射可靶向腫瘤組織，提高免疫檢查點(diǎn)阻斷癌癥療法[48]. Zou等設(shè)計(jì)了一種基于細(xì)菌外膜囊泡與源于腫瘤的細(xì)胞膜雜交成的混合囊泡系統(tǒng)(mTOMV) (圖5)，該囊泡系統(tǒng)有效靶向腫瘤區(qū)域并激活同源腫瘤中的適應(yīng)性免疫，通過“雙管齊下”的策略抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移[49]. 基于OMV與細(xì)胞膜相似的脂質(zhì)雙分子層結(jié)構(gòu)具有穿透角質(zhì)層透皮遞送藥物的優(yōu)勢. Peng等收集了源于轉(zhuǎn)基因大腸桿菌的外膜囊泡，并用整合素肽αvβ3靶向配體和吲哚菁綠共軛外膜囊泡，從而形成I-P-OMVs. 應(yīng)用于黑色素瘤部位后，I-P-OMVs能夠穿透皮膚并靶向黑色素瘤區(qū)域，近紅外刺激觸發(fā)誘導(dǎo)熱療效應(yīng)并分泌單線態(tài)氧，迅速清除原發(fā)性黑色素瘤球體并誘導(dǎo)黑色素瘤細(xì)胞凋亡[50]. 該囊泡系統(tǒng)的生物相容性良好，制備程序簡單便捷，具有巨大的臨床應(yīng)用潛力.

Fig. 5  Hybrid vesicles from bacteria outer membrane and tumor cell membrane to enhance innate immune response (Reprinted with permission from Ref.[49]; Copyright (2021) American Chemical Society).

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細(xì)菌之間存在交互協(xié)同作用，因此，基于組合細(xì)菌療法的級聯(lián)效應(yīng)可提高化學(xué)生產(chǎn)效率與生物利用度，同時(shí)提升治療效果. 近年來，新引入的3D打印平臺可以將細(xì)菌嵌入到具有高度生物相容性的3D打印油墨中，打印出同時(shí)包含2種益生菌的“活材料”，用于降解污染物并產(chǎn)生醫(yī)學(xué)上相關(guān)的細(xì)菌纖維素[51,52]. Chen等構(gòu)建了同時(shí)含有保加利亞乳桿菌(LDB)和鼠李糖乳桿菌(LGG)的雙益生菌梯度遞送系統(tǒng)(圖6(a)). 進(jìn)入腸道后，先釋放的LGG在減少肝臟膽汁酸合成的同時(shí)促進(jìn)膽汁酸排泄，而被海藻酸鈣微球固定的LDB通過多種機(jī)制主動聚集膽汁酸. 研究發(fā)現(xiàn)，LGG-LDB組裝系統(tǒng)可以通過調(diào)節(jié)腸-肝軸有效預(yù)防膽汁淤積性肝損傷(圖6(b)) [53]. Zheng等通過微流控技術(shù)將3種細(xì)菌封裝在海藻酸鈣凝膠球中，在凝膠表面聚合一層聚多巴胺納米膜，成功構(gòu)建了一個基于3種不同細(xì)菌(埃希氏桿菌屬、芽孢桿菌屬及腸桿菌屬)的人工生態(tài)系統(tǒng). 這3株細(xì)菌可通過級聯(lián)反應(yīng)將尿素和肌酐高效轉(zhuǎn)化成氨基酸[54]. 以上研究說明，選擇合適的聚合物有利于放大組合細(xì)菌間的級聯(lián)效應(yīng).

Fig. 6  The synthesis procedure of dual probiotics-incorporated living materials (Reprinted with permission from Ref.?[53]; Copyright (2022) Wiley-VCH GmbH).

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2 工程化細(xì)菌的生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用

2.1 疾病診斷

細(xì)菌可自主感知生理信號，并能響應(yīng)周圍環(huán)境(包括宿主)的變化. 因此，細(xì)菌有望為一些疾病的風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測、診斷和術(shù)后康復(fù)提供參考依據(jù). 例如，厭氧細(xì)菌可對腫瘤部位的趨向性進(jìn)行腫瘤特異性成像，同時(shí)瘤內(nèi)缺氧與免疫抑制微環(huán)境使細(xì)菌能夠在腫瘤內(nèi)增殖，實(shí)現(xiàn)腫瘤內(nèi)細(xì)菌的長時(shí)程成像. 然而，常用的大腸桿菌成像的缺點(diǎn)在于其會產(chǎn)生藍(lán)移發(fā)射光譜，波長峰值范圍為470~490 nm，并非最適合體內(nèi)成像的波長. 因此，表達(dá)熒光素酶的重組大腸桿菌可用于體外和體內(nèi)細(xì)菌跟蹤，為細(xì)菌輔助癌癥治療的研究提供光學(xué)靶向腫瘤的應(yīng)用平臺[55]. 工程化的大腸桿菌可將目標(biāo)基因靶向遞送至腫瘤區(qū)域，通過基于光開關(guān)的光聲成像方法抑制血液背景噪音，從而實(shí)現(xiàn)腫瘤內(nèi)細(xì)菌的精準(zhǔn)定位與光聲成像[56,57]. 由于可以間隔距離施加磁力，磁性材料對胃腸道手術(shù)特別有用. 將其與工程細(xì)菌結(jié)合形成的磁性活水凝膠可附著到腹部皮膚并定位駐留，從而抵抗腸道中的蠕動，攝入的水凝膠可維持細(xì)菌活性長達(dá)7天，用于檢測胃腸道出血[58].

在生物傳感設(shè)備中，以細(xì)菌為主導(dǎo)的生物傳感器被廣泛用于分析物的檢測與定量. 這是由于細(xì)菌不僅可以快速感知體內(nèi)復(fù)雜的生理環(huán)境，還可以自我復(fù)制有利于生物傳感器的信號放大. Courbet等構(gòu)建了一種基于工程大腸桿菌的信號放大生物傳感器，用于檢測人類尿液和血清中的臨床相關(guān)生物標(biāo)志物. 該工程細(xì)菌集成了多個轉(zhuǎn)錄本，可以同時(shí)檢測和分析多個生物標(biāo)志物，提高了診斷測試的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性[59]. 同時(shí)，把細(xì)菌生物傳感器封裝在載體中，攝入后便可以實(shí)現(xiàn)生物體內(nèi)的實(shí)時(shí)監(jiān)測. Mimee等開發(fā)了一種配備微電子器件和基因工程細(xì)菌的微膠囊，工程大腸桿菌以微創(chuàng)方式檢測血液中的出血標(biāo)志物(血紅素)并產(chǎn)生熒光信號，隨后激活相鄰的電子電路以產(chǎn)生無線信號[60]. 由此可見，生物工程細(xì)菌和電子設(shè)備的結(jié)合為疾病診斷提供了新型的監(jiān)測模式.

2.2 疾病治療

細(xì)菌可以直接用于治療疾病，也可以用作藥物、基因療法的載體. 基于工程細(xì)菌的癌癥療法引起了人們越來越濃厚的興趣[61]. 其中，腦膠質(zhì)瘤由于存在血腦屏障嚴(yán)重限制了治療藥物隨著循環(huán)血液進(jìn)入腫瘤所在的大腦，而腦膜炎奈瑟菌含有Opca的外膜侵襲蛋白，可以特異性富集在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中[62]. 基于該想法，Dong等通過腦膜炎奈瑟菌的Opca蛋白設(shè)計(jì)了一種仿生納米治療系統(tǒng)(圖7(a))，穿過血腦屏障將化療藥物滲透到腫瘤組織中. 這種仿生納米治療系統(tǒng)在治療膠質(zhì)母細(xì)胞瘤方面表現(xiàn)出巨大的潛力(圖7(b)) [62]. 此外，兼性厭氧菌沙門氏菌VNP20009在全身注射后可以選擇性定植到腫瘤中，但是I期臨床試驗(yàn)顯示VNP20009的抗腫瘤作用較弱. 因此，Chen等設(shè)計(jì)了沙門氏菌聯(lián)合光熱療法來提高抗腫瘤的特異性和有效性. 其過程是，通過氧化和自聚合在VNP20009上涂覆一層聚多巴胺，然后通過尾靜脈注射到荷瘤小鼠體內(nèi). 聚多巴胺包被的VNP20009靶向?qū)嶓w瘤的缺氧區(qū)域，在光調(diào)節(jié)下光熱劑會導(dǎo)致局部溫度升高，最終殺死周圍的腫瘤細(xì)胞. 這種組合療法在單次治療下顯示了優(yōu)越的抗癌效果，并抑制腫瘤復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移[63]. 非侵入性大腸桿菌已成為一類相對安全的生物載體，常用于將質(zhì)粒DNA遞送到哺乳動物細(xì)胞中. Zhu等結(jié)合化學(xué)和基因工程方法，將表達(dá)毒素質(zhì)粒pET28a-PE66轉(zhuǎn)染到大腸桿菌BL21中，接著通過靜電和疏水相互作用將ROS敏感的陽離子共軛聚電解質(zhì)包被在細(xì)菌表面. 工程細(xì)菌聯(lián)合化療和光動力療法，可實(shí)現(xiàn)更為精準(zhǔn)和個體化的抗腫瘤效果[64].

Fig. 7  (a) Preparation of biomimetic nanotherapeutic system; (b) Schematic diagram of the nanotherapeutic system to treat glioblastoma (Reprinted with permission from Ref.[62]; Copyright (2022) Wiley-VCH GmbH).

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胃腸道定植的微生物構(gòu)成了一個龐大的生態(tài)系統(tǒng)，腸道微生物與宿主的平衡關(guān)系一旦打破，勢必會引發(fā)多種疾病[65]. 因此許多研究通過調(diào)節(jié)腸道菌群平衡來治療胃腸道疾病. Pan等將單寧酸和鐵離子組成的超分子涂層在益生菌的表面，保護(hù)益生菌免受細(xì)胞攝取和抗生素的殺傷. 涂層的益生菌可以定植在左氧氟沙星治療的大鼠胃腸道內(nèi)，減輕胃腸道炎癥并改善左氧氟沙星等抗生素治療引起的相關(guān)性腹瀉[66]. 然而，復(fù)雜的胃腸道環(huán)境，如胃中的強(qiáng)酸、膽汁酸和腸道中不同的酶，均不利于益生菌的生存. 基于此，Liu等設(shè)計(jì)了一種雙層包衣策略，采用單寧酸和腸溶L100對大腸桿菌 Nissle 1917進(jìn)行封裝. 包衣的益生菌對惡劣的胃腸道環(huán)境表現(xiàn)出強(qiáng)抵抗力，pH響應(yīng)性的外層腸溶L100在腸道中選擇性地釋放大腸桿菌，從而延長細(xì)菌在腸道中的保留時(shí)間，對結(jié)腸炎具有優(yōu)異的預(yù)防和治療效果[67].

益生菌通過分泌大量代謝物和抗菌劑來創(chuàng)造獨(dú)特的局部微環(huán)境，這些代謝物和抗菌劑亦適合細(xì)菌的生存[68]. 羅伊氏乳桿菌作為代表性的益生菌，常被用作傷口愈合及組織再生的載體[69]. V?gesj?等用編碼CXCL12的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染羅伊氏乳桿菌，將其作為載體開發(fā)了一種可持續(xù)釋放趨化因子CXCL12的系統(tǒng)，用于慢性傷口的治療[70]. CXCL12可以將糖尿病小鼠傷口的巨噬細(xì)胞重編程為抗炎表型，然后用于組織修復(fù). 同時(shí)，羅伊氏乳桿菌產(chǎn)生的乳酸可以降低傷口的局部pH值，防止CXCL12的降解并延長其生物利用度. 分別在急性傷口、下肢缺血、糖尿病小鼠傷口以及人類皮膚活檢標(biāo)本中驗(yàn)證了該工程細(xì)菌加速傷口愈合的獨(dú)特功效. Ming等用甲基丙烯酸改性的透明質(zhì)酸水凝膠包裹羅伊氏乳桿菌，該活菌水凝膠顯示出了優(yōu)越的抗菌效果和加速傷口愈合的能力[71].

3 臨床研究

近年來，工程化細(xì)菌用于不同實(shí)驗(yàn)動物模型的研究為細(xì)菌療法的臨床轉(zhuǎn)化提供了可行性. 目前FDA已經(jīng)批準(zhǔn)了幾株減毒的活菌或死菌疫苗，包括用于預(yù)防肺結(jié)核和癌癥治療的牛型結(jié)核分枝桿菌卡介苗、用于霍亂的霍亂弧菌Vaxchora疫苗[72,73]. 如表1所示，在全球范圍內(nèi)，基于工程化細(xì)菌治療腫瘤的研究在各種臨床試驗(yàn)中也取得了巨大的成功. 同時(shí)，天然存在的益生菌和糞便微生物群移植用于預(yù)防治療各種胃腸道疾病的臨床研究也頗見成效[74,75].

Table 1  Clinical investigation of bacteria-based therapies.

Bacteria Administration Clinical trials. Gov identifier Indication Clinical trial stage Ref.

Staphylococcus hominis Transdermal NCT03151148 Atopic dermatitis Phase 1/2 [76]

Salmonella typhimurium Oral NCT01099631 Unresectable hepatic spread Phase 1 [77]

Oral NCT01033409 Pneumonia Phase 1 [78]

Intravenous NCT00004988 Cancer Phase 1 [79]

Intratumoral NCT00004216 Unspecified adult solid tumor Phase 1 [80]

Oral NCT04589234 Metastatic pancreatic cancer Phase 2 [81]

Oral NCT03762291 Multiple myeloma Phase 1 [82]

E. coli Intramuscular NCT03168412 Hepatitis E CDA approval [83]

Oral NCT02144948 Diabetes mellitus type II Phase 3 [84]

Cholera vaccine Oral STN:125597 Cholera FDA approval [73]

Listeria Intravenous NCT03190265 Pancreatic cancer Phase 2 [85]

Lactic acid bacteria Oral NCT00613795 Pneumonia Phase 3 [86]

Lactobacillus Vaginal NCT02766023 Bacterial vaginosis Phase 2 [87]

Vaginal NCT00305227 Urinary tract infection Phase 2 [88]

Oral, rectal NCT00729872 Ulcerative colitis Phase 1/2 [89]

Oral NCT01773967 Gastroenteritis Phase 2/3 [90]

Fecal microbiota transplantation Colonoscopy NCT02743234 Clostridium difficile infection Phase 3 [91]

Colonoscopy NCT02424175 Sclerosing cholangitis Phase 1/2 [92]

下載: 導(dǎo)出CSV

盡管大量研究證明工程化細(xì)菌在不同實(shí)驗(yàn)動物模型中的治療效果顯著，但是細(xì)菌在人體組織中的吸收、分布、代謝和排泄方面也存在差異. 因此，細(xì)菌療法在動物試驗(yàn)中取得的數(shù)據(jù)并不能完全反映其對人體的影響. 總之，確定系統(tǒng)化的臨床前研究標(biāo)準(zhǔn)將有助于細(xì)菌療法從實(shí)驗(yàn)室階段安全有效地轉(zhuǎn)化到臨床階段.

4 總結(jié)與展望

隨著研究的深入，工程化細(xì)菌已經(jīng)在許多難治性疾病上顯示了出色的治療效果，如癌癥、胃腸道疾病和免疫缺陷病等. 工程化細(xì)菌既可以用作治療劑，也可作為治療性藥物的遞送載體，因而具有廣闊的應(yīng)用前景. 然而，與傳統(tǒng)藥物不同，活細(xì)菌可以在體內(nèi)增殖，且在不同患者體內(nèi)增殖的規(guī)模也存在差異，這會導(dǎo)致遞送細(xì)菌的劑量變得不可控制. 此外，細(xì)菌因體內(nèi)脫靶效應(yīng)所引發(fā)的毒副作用亦不可忽視. 因此，如何在提高細(xì)菌療法的安全性的同時(shí)，增強(qiáng)其靶向性與治療效果，是細(xì)菌療法走向臨床應(yīng)用轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵.

在今后的細(xì)菌遞送治療研究中，一方面結(jié)合化學(xué)和生物學(xué)技術(shù)對細(xì)菌進(jìn)行改造，或利用基因工程敲除細(xì)菌的特定基因，在疾病診療有效性與安全性之間取得平衡. 另一方面，需要進(jìn)一步探討細(xì)菌如何與人體相互作用，推進(jìn)工程化細(xì)菌對各種疾病治療的臨床轉(zhuǎn)化.