發(fā)酵大豆蛋白肽粉營養(yǎng)價值及功效性研究

大豆蛋白食品具有保健、預(yù)防相關(guān)疾病的功效，諸如調(diào)節(jié)人體血脂，降低膽固醇、脂肪肝，減少患心血管病的危險，預(yù)防膽結(jié)石的形成；調(diào)節(jié)人體鈣質(zhì)的代謝，從而降低患骨質(zhì)疏松癥的危險，預(yù)防腎結(jié)石的形成；調(diào)節(jié)性激素效應(yīng)，從而減輕婦女更年期綜合征癥狀等[1-2]。但大豆分離蛋白分子質(zhì)量較大，分子結(jié)構(gòu)也較為復(fù)雜，食用后消化吸收慢，且含有多種抗?fàn)I養(yǎng)因子[3]、致敏成分[4]等，影響其營養(yǎng)價值及應(yīng)用。作為一種先進的蛋白質(zhì)加工技術(shù)，“酶膜耦合”定向酶解，聯(lián)合復(fù)合菌種發(fā)酵技術(shù)可解決上述問題。該技術(shù)，可破壞原料蛋白過敏原的構(gòu)象表位和線性表位，降低過敏性風(fēng)險，去除抗?fàn)I養(yǎng)因子，改善消化吸收特性。但針對此技術(shù)生產(chǎn)的發(fā)酵大豆蛋白肽粉營養(yǎng)價值及功效性未見報告，故本研究開展發(fā)酵大豆蛋白肽粉的營養(yǎng)價值及功效性研究，以期為以后的應(yīng)用提供支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

大豆分離蛋白，禹王；乳清蛋白(蛋白質(zhì)含量≥80%)，丹麥Arla；發(fā)酵大豆蛋白肽粉：以大豆分離蛋白為原料，先通過蛋白酶進行部分酶解，然后使用類干酪乳桿菌、戊糖片球菌復(fù)合菌種發(fā)酵制得；野生型AB品系斑馬魚：實驗動物使用許可證號為SYXK(浙)2012—0171，飼養(yǎng)管理符合國際AAALAC認(rèn)證(認(rèn)證編號：001458)的要求。

1.1.2 試劑

胃蛋白酶和胰酶，Sigma；4%組織細(xì)胞固定液，Solarbio；二甲苯，上海麥克林生化科技有限公司；PBS緩沖液，武漢博士德生物工程有限公司；Mayer蘇木素染色液、伊紅染色液、中性樹脂封片劑，上海依赫生物科技有限公司；無水乙醇，國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

CX31生物顯微鏡、SZX7解剖顯微鏡，日本OLYMPUS；VertAl CCD相機，上海土森視覺科技有限公司；CP214精密電子天平，美國OHAUS；6孔板、12孔板、96孔板，中國Nest Biotech；SPARK多功能酶標(biāo)儀，瑞士TECAN。

1.3 實驗方法

1.3.1 體外消化模擬試驗

胃消化、腸道消化模擬實驗方法參考文獻[5]。

1.3.2 致敏性評價試驗

檢測方法及原理參考文獻[6-7]，詳細(xì)操作如下：隨機選取300尾4 dpf野生型AB品系斑馬魚于12孔板中，每孔(實驗組)均處理10尾斑馬魚。根據(jù)前期濃度摸索結(jié)果，發(fā)酵大豆蛋白肽粉對正常斑馬魚的無可見有害作用水平(no observed adverse effect level,NOAEL)為500 μg/mL，以NOAEL劑量1/9、1/3和1設(shè)定低劑量組、中劑量組和高劑量組，即發(fā)酵大豆蛋白肽粉質(zhì)量濃度為55.6、167、500 μg/mL，同時設(shè)置正常對照組。每孔容量為1 mL，每個實驗組設(shè)置6個平行。各實驗組與N-苯甲酰-DL-精氨酸對硝基苯酰胺鹽酸鹽(N-benzoyl-DL-arginine-p-nitroaniline HCl, BAPNA)共同處理24 h后，將液體轉(zhuǎn)移至96孔板中，250 μL/孔，利用酶標(biāo)儀檢測各實驗組類胰蛋白酶的相對吸光度值，以吸光度值(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)評價發(fā)酵大豆蛋白肽粉誘發(fā)類過敏的情況。

1.3.3 肌肉保護試驗

檢測方法參考COFFEY等[8]研究,詳細(xì)操作如下：隨機選取120尾2 dpf野生型AB品系斑馬魚于6孔板中，每孔(實驗組)均處理30尾斑馬魚。除正常對照組外，其余各實驗組均給予1.5%無水乙醇、24 h，建立斑馬魚酒精性肌損傷模型。分別給予以下樣品：發(fā)酵大豆蛋白肽粉和乳清蛋白質(zhì)量濃度均為102.30 μg/mL，同時設(shè)置正常對照組和模型對照組，每孔容量為3 mL。28 ℃處理24 h后，用4%組織細(xì)胞固定液固定，對斑馬魚進行蘇木精-伊紅染色(固定-脫水-包埋-切片-染色)，并進行病理學(xué)分析評價樣品肌肉保護功效。評分標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 斑馬魚肌肉保護功效評價標(biāo)準(zhǔn)
Table 1 Evaluation criteria for muscle protection of zebrafish

2 結(jié)果與分析

2.1 營養(yǎng)成分分析

由表2、表3可以看出，大豆分離蛋白粉通過部分酶解，蛋白質(zhì)的含量略有降低，但氨基酸構(gòu)成比例幾乎沒有變化，但發(fā)酵大豆蛋白肽粉形成整蛋白、多肽、低聚肽、氨基酸等多重氮源，可以實現(xiàn)梯度吸收，降低代謝負(fù)擔(dān)。通過發(fā)酵，碳水化合物含量略有增加，主要是因為通過發(fā)酵產(chǎn)生一定量有機酸等后生元成分。有機酸能夠提高胃酸分泌量，促進營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收。同時有機酸可以降低腸道內(nèi)pH值，具有重要的腸道調(diào)節(jié)功能。

表2 發(fā)酵大豆蛋白肽粉與大豆分離蛋白粉營養(yǎng)成分對比分析
Table 2 Nutritional components of fermented soybean protein peptide powder and soybean protein isolate powder

注：/，未檢測

2.2 體外消化模擬試驗

大豆分離蛋白粉通過部分酶解及復(fù)合菌種發(fā)酵之后胃消化率由原來的68.57%提高到81.61%，腸消化率由原來的76.35%提高到87.49%。發(fā)酵大豆蛋白肽粉可能是通過部分酶解形成蛋白質(zhì)和肽混合，通過發(fā)酵產(chǎn)生一些有機酸等代謝產(chǎn)物，這些成分在水溶液中會通過分子間相互作用力，比如氫鍵、范德華力等相互結(jié)合，使得蛋白酶與蛋白質(zhì)的結(jié)合位點被暴露，從而促進蛋白的消化。

表3 發(fā)酵大豆蛋白肽粉與大豆分離蛋白粉氨基酸組成對比分析 單位：%

Table 3 Amino acids composition of fermented soybean protein peptide powder and soybean protein isolate powder

2.3 致敏性評價試驗

類胰蛋白酶是肥大細(xì)胞內(nèi)預(yù)先合成的中性蛋白酶，是臨床上檢驗人體是否過敏的重要指標(biāo)[9-10]。受肥大細(xì)胞活化劑BAPNA作用后，斑馬魚會產(chǎn)生過敏反應(yīng)，誘導(dǎo)肥大細(xì)胞分泌類胰蛋白酶。類胰蛋白酶的OD值與類過敏反應(yīng)程度成正相關(guān)。斑馬魚致敏性試驗結(jié)果見表4。

表4 致敏性評價實驗結(jié)果
Table 4 Experimental results of sensitization evaluation

注：***，P<0.001，相對于正常對照組極顯著差異

由表4可知，發(fā)酵大豆蛋白肽粉55.6、167、500 μg/mL質(zhì)量濃度組OD值分別為0.116、0.085、0.094，與正常對照組相比具有極其顯著性差異，分別降低了43%、58%、53%，說明發(fā)酵大豆蛋白肽粉在一定濃度范圍內(nèi)不會誘發(fā)類過敏反應(yīng)，降低致敏性風(fēng)險同時可能存在抗敏性。

2.4 肌肉保護試驗

由圖1可知正常對照組斑馬魚肌肉細(xì)胞呈均一長條狀，且橫紋清晰，模型對照組肌纖維松弛，但未見浸潤和壞死，乳清蛋白及發(fā)酵大豆蛋白肽粉處理組肌纖維紋理清晰、結(jié)構(gòu)緊密，與正常對照組較為相似，具有明顯的肌肉保護功效。

a-正常對照組；b-模型對照組； c-乳清蛋白組102.3 μg/mL；d-發(fā)酵大豆蛋白肽組102.3 μg/mL
圖1 斑馬魚肌肉保護試驗病理切片圖
Fig.1 Pathological section of zebrafish muscle protection test

由表5可知，模型對照組相比于正常對照組具有極其顯著性差異，說明造模成功。乳清蛋白組及發(fā)酵大豆蛋白肽組相對模型對照組具有極顯著性差異，說明乳清蛋白和發(fā)酵大豆蛋白對斑馬魚都具有肌肉保護作用。乳清蛋白組相對發(fā)酵大豆蛋白肽粉組沒有顯著性差異，說明發(fā)酵大豆蛋白肽粉對肌肉保護作用效果等同于乳清蛋白。

表5 肌肉保護試驗結(jié)果匯總表
Table 5 Summary of muscle protection test results

注：總分0分為正常；1～4分輕度肌肉損傷；5～6分為中度肌肉損傷；7分及以上為重度肌肉損傷；**，相對于正常組極顯著差異；&&，相對于模型對照組極顯著差異；(P<0.01)

3 結(jié)論

發(fā)酵大豆蛋白肽粉以大豆分離蛋白為原料，通過現(xiàn)代生物“酶膜耦合”定向酶解和復(fù)合菌種發(fā)酵技術(shù)精制而成，富含整蛋白、多肽、低聚肽、有機酸等活性成分。體外消化試驗顯示發(fā)酵大豆蛋白肽粉相對大豆分離蛋白在胃、腸道消化率均有提高，李世成等[11]研究發(fā)現(xiàn)相對補充大豆分離蛋白，補充大豆低聚肽具有更高的表觀消化率、儲存率和凈氮利用率，與本文結(jié)論相似。致敏性評價結(jié)果顯示發(fā)酵大豆蛋白肽粉致敏性降低，在一定濃度下不會誘發(fā)致敏性反應(yīng)，具有抗過敏性作用，可能機理為大豆分離蛋白通過酶解和發(fā)酵破壞了原料蛋白過敏原的構(gòu)象表位和線性表位，弱化過敏信號通路，有效降低了致敏風(fēng)險，與前人研究結(jié)果一致[12-13]。乳清蛋白富含支鏈氨基酸尤其是亮氨酸，且乳清蛋白屬于快膳食蛋白[14]，是被認(rèn)為抵抗肌肉衰減最有效的蛋白質(zhì)之一，對肌肉具有較強保護作用[15]，多個研究表明乳清蛋白在增肌，促進肌肉合成方面優(yōu)于大豆蛋白[16-19]。但長期補充乳清蛋白質(zhì)可能會對腸道微生物群產(chǎn)生負(fù)面影響[20]。本實驗肌肉保護實驗顯示發(fā)酵大豆蛋白肽粉具有肌肉保護作用，同時具有低致敏性，其在預(yù)防老年肌肉衰減產(chǎn)品及運動增肌產(chǎn)品應(yīng)用前景廣闊。