市售飲料對(duì)變異鏈球菌和白色念珠菌雙菌致齲性的影響

齲齒是最常見(jiàn)的口腔細(xì)菌感染性疾病之一。其中，學(xué)齡前兒童患齲齒即低齡兒童齲(early childhood caries，ECC)的發(fā)生率位居兒童疾病的首位，嚴(yán)重危害兒童的健康[1]。齲齒的發(fā)生與微生物[2]、飲食[3]、宿主生活習(xí)慣等因素密切相關(guān)，其中微生物主導(dǎo)的牙菌斑生物膜的形成是齲齒的始動(dòng)因子。生物膜是口腔微生物在牙齒表面定植并不斷生長(zhǎng)繁殖而形成的三維立體的微生態(tài)結(jié)構(gòu)，能保護(hù)細(xì)菌免受藥物的侵害，較浮游狀態(tài)下顯著提高了藥物耐受性。變異鏈球菌具有很強(qiáng)的代謝蔗糖產(chǎn)酸并形成致齲性生物膜的能力，是公認(rèn)的主要的致病菌。近年來(lái)臨床研究又發(fā)現(xiàn)，白色念珠菌參與了齲齒的進(jìn)程，在患ECC的兒童口腔菌斑生物膜中檢出大量的白色念珠菌和變異鏈球菌[4]，二者相互作用會(huì)形成致齲性更強(qiáng)的生物膜[5-6]。

兒童對(duì)糖類(lèi)的偏好等不健康的飲食習(xí)慣往往會(huì)加重齲齒的發(fā)生，大部分的飲料均添加了大量的蔗糖。飲食中的糖類(lèi)物質(zhì)可與齲病微生物形成的牙菌斑生物膜直接接觸，為微生物提供碳源，使微生物定點(diǎn)產(chǎn)酸，導(dǎo)致牙齒脫礦，最后形成齲齒[7]。同時(shí)飲料中的酸也是重要的致齲因素[7]。不同類(lèi)型飲料的酸和糖含量不同，故對(duì)齲齒具有不同程度的影響。羅彥妮[8]通過(guò)體外模型評(píng)定了4種乳飲料對(duì)變異鏈球菌生物膜的形成、產(chǎn)酸、牙齒脫礦等指標(biāo)的影響，結(jié)果表明全脂牛奶致齲能力較低，椰奶具有較高的致齲能力，豆奶及核桃奶致齲能力處于中等水平；胡霞[9]通過(guò)采用Keyes經(jīng)典評(píng)分方法評(píng)價(jià)了去離子水、可口可樂(lè)、鮮橙多和雪碧在大鼠模型中的致齲性，結(jié)果表明可口可樂(lè)、鮮橙多和雪碧對(duì)大鼠的牙齒均有酸蝕作用，會(huì)導(dǎo)致齲齒。而兒童偏好的飲料對(duì)于ECC中主要致齲菌白色念珠菌和變異鏈球菌雙菌的致齲性影響尚未見(jiàn)報(bào)道。

牙菌斑生物膜的形成是齲病的始動(dòng)因素，而飲料本身的酸會(huì)導(dǎo)致牙齒的酸蝕進(jìn)而導(dǎo)致齲洞的產(chǎn)生。本研究以常見(jiàn)的市售飲料：碳酸飲料、果汁、乳制品和水為研究對(duì)象，探究它們的酸度、對(duì)雙菌生物膜形成量的影響、對(duì)羥基磷灰石脫礦程度等指標(biāo)，以評(píng)價(jià)不同飲料對(duì)雙菌致齲性的影響，為兒童飲料的選擇提供參考，也為替代性飲料配方的改良提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 菌株、試劑與培養(yǎng)基

變異鏈球菌(Streptococcus mutans)ATCC 25175、白色念珠菌(Candida albicans)ATCC 18804，中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心，現(xiàn)保藏于江南大學(xué)食品生物技術(shù)中心；哈維氏弧菌(Vibrio harveyi)BB170，保藏于江南大學(xué)食品生物技術(shù)中心；紫色桿菌(Chromobacterium violaceum)CV026，由江南大學(xué)食品安全與質(zhì)量控制中心姚衛(wèi)蓉老師惠贈(zèng)。

結(jié)晶紫、甲醇、無(wú)水乙醇、羥基磷灰石，國(guó)藥滬試；人工唾液，北京百奧萊博科技有限公司；康寧96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，南通市海之星實(shí)驗(yàn)器材有限公司；2216E培養(yǎng)基，青島海博；C6-HSL，Sigma。

可口可樂(lè)、雪碧、芬達(dá)，可口可樂(lè)中國(guó)公司；冰糖雪梨、水晶葡萄、橙汁、純凈水，康師傅控股有限公司；純牛奶、酸奶，光明乳業(yè)股份有限公司；上述飲料均購(gòu)自江南大學(xué)世紀(jì)華聯(lián)超市。

TSB培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨17.0，酵母粉6.0，NaCl 5.0，大豆蛋白胨3.0，葡萄糖2.5，K2HPO4 2.5，pH 7.0～7.4；YPD培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨20，葡萄糖20，酵母粉10；LB培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl 10；以上培養(yǎng)基均在115 ℃高壓滅菌 20 min。AB培養(yǎng)基(mol/L)：0.3 NaCl，0.05 Mg2SO4、2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))酸水解酪蛋白，115 ℃高壓滅菌 20 min后加入10 mL 1 mol/L的無(wú)菌磷酸鉀緩沖液，10 mL 0.1 mol/L的無(wú)菌精氨酸溶液和20 mL 50%(體積分?jǐn)?shù))無(wú)菌甘油。

1.2 儀器與設(shè)備

Multiscan Go全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀，賽默飛世爾科技有限公司；臺(tái)式冷凍高速離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf公司；NexION 350D電感耦合等離子體質(zhì)譜儀，美國(guó)Perkin Elmer公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 菌株的培養(yǎng)

取出-80 ℃保藏的變異鏈球菌ATCC 25175，以2%的接種量接種于5 mL TSB液體培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)18 h。以相同的接種量將白色念珠菌ATCC 18804接種于YPD液體培養(yǎng)基中，37 ℃搖床培養(yǎng)18 h。紫色桿菌CV026接種于含10 μg/mL卡鈉霉素的LB培養(yǎng)基中，28 ℃搖床培養(yǎng)過(guò)夜。哈維氏弧菌BB170接種于2216E液體培養(yǎng)基，28 ℃搖床培養(yǎng)過(guò)夜。所有菌株均活化3代后再用于實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 不同飲料緩沖能力及pH的測(cè)定

通過(guò)pH滴定法檢測(cè)飲料的緩沖能力，并將pH值改變1個(gè)單位所需的1 mol/L HCl的物質(zhì)的量記錄為緩沖容量。測(cè)定培養(yǎng)前飲料的初始pH和飲料與致病菌混合體系培養(yǎng)后的pH[8]。

1.3.3 不同飲料對(duì)雙菌生物膜形成的影響

將變異鏈球菌和白色念珠菌以2%的接種量分別接種至新鮮質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%蔗糖的TSB和YPD培養(yǎng)基，于96孔板中加入致病菌菌懸液各75 μL，再加入50 μL待測(cè)飲料，對(duì)照以無(wú)菌純凈水代替。培養(yǎng)24 h后，去除上清液，用PBS小心清洗生物膜2遍，室溫靜置晾干生物膜后向每孔加入100 μL甲醇以固定生物膜，10 min后除去甲醇，自然晾干，加入100 μL 0.1%結(jié)晶紫溶液，將生物膜染色30 min，染色結(jié)束后用PBS清洗2遍，每孔以體積分?jǐn)?shù)33%的冰醋酸溶解，用酶標(biāo)儀OD600 nm讀取吸光度值[10]。

1.3.4 不同飲料對(duì)雙菌群體感應(yīng)系統(tǒng)的影響

參考丁婷等[11]的方法，將紫色桿菌CV026涂布于LB瓊脂培養(yǎng)基表面，使用濾紙片法，加入10 μL雙菌共培養(yǎng)的上清液，室溫孵育1 h，之后在28 ℃下過(guò)夜培養(yǎng)。以C6-HSL作為陽(yáng)性對(duì)照，甲醇作為陰性對(duì)照。在孔周?chē)^察紫色光圈，有紫色圈說(shuō)明群體感應(yīng)過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生酰基高絲氨酸內(nèi)酯(acylated homoserine lactones，AHL)。

參考ZHU等[12]的方法，采用哈維氏弧菌BB170生物發(fā)光法檢測(cè)變異鏈球菌和白色念珠菌種間自誘導(dǎo)分子AI-2的活性。在24孔板中加入變異鏈球菌和白色念珠菌菌懸液各375 μL，再加入250 μL待測(cè)飲料，對(duì)照以無(wú)菌水代替飲料，培養(yǎng)24 h后，收集、過(guò)濾獲得無(wú)菌上清液，備用?；罨蟮墓S氏弧菌BB170 接種于AB培養(yǎng)基，30 ℃、180 r/min 培養(yǎng)12 h，調(diào)節(jié)菌液OD595 nm為0.8左右，再用無(wú)菌新鮮AB培養(yǎng)基按 1∶2 000稀釋該菌液，混勻備用。按1∶50比例將上述收集的上清液與哈維氏弧菌BB170稀釋菌懸液混合。30 ℃、100 r/min 搖瓶培養(yǎng)5 h，避光條件下吸取200 μL于黑色不透明酶標(biāo)板中，以多功能酶標(biāo)儀于OD500 nm檢測(cè)哈維氏弧菌BB170化學(xué)發(fā)光情況，以無(wú)菌水作為陰性對(duì)照。

1.3.5 不同飲料對(duì)唾液包被羥基磷灰石鈣流失率的影響

參考秦蘇佳等[13]的方法，稍有改動(dòng)。按照1 mg羥基磷灰石:200 μL人工唾液的比例充分混勻，取200 μL懸浮液包被96孔板，37 ℃孵育過(guò)夜。然后2 000 r/min離心10 min。棄上清液，風(fēng)干后的96孔板即為包被好的羥基磷灰石模型。

將唾液包被的羥基磷灰石放入96孔板中，將變異鏈球菌和白色念珠菌以2%的接種量分別接種至新鮮含1%蔗糖的TSB和YPD培養(yǎng)基，隨后加入該致病菌菌懸液各75 μL，再加入50 μL待測(cè)飲料，對(duì)照以無(wú)菌純凈水代替飲料，培養(yǎng)24 h后取培養(yǎng)液8 000 r/min離心5 min，上清樣品經(jīng)硝酸消化后在電感耦合等離子體質(zhì)譜儀下測(cè)定鈣離子濃度[13]。

1.3.6 數(shù)據(jù)分析

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次以上，數(shù)據(jù)分析使用Graphpad Prism 8.4.3，SPSS，R studio。使用One-way anova進(jìn)行方差分析，P<0.05表示具有顯著性差異，使用R包pheatmap等進(jìn)行聚類(lèi)熱圖分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同飲料的酸度和緩沖能力

本研究所選的飲料含糖量接近，但酸度相差較大，而飲料本身的酸度是重要的致齲因素，可以導(dǎo)致牙齒的酸蝕。pH值和緩沖容量是反映飲料的酸蝕能力的重要指標(biāo)[14]。從圖1-a可知，果汁和碳酸飲料均具有較低的pH(<4)，而牛奶和礦泉水則呈現(xiàn)中性，pH為7左右，而酸奶由于本身黏度較高，無(wú)法直接測(cè)定，將其稀釋至原濃度1/10，其pH在4左右。飲料的緩沖能力是通過(guò)測(cè)量其緩沖容量來(lái)評(píng)價(jià)的，通常飲料中所含的酸式鹽使其具有一定的緩沖能力，通過(guò)測(cè)量緩沖容量即pH值改變1個(gè)單位所需的1 mol/L HCl的物質(zhì)的量可以反映飲料的緩沖能力。

a-飲料的初始pH；b-飲料的緩沖容量
圖1 飲料的酸蝕能力
Fig.1 Etching ability of beverages

從圖1-b可知，可樂(lè)的緩沖容量最強(qiáng)，可能具有最強(qiáng)的酸蝕能力，會(huì)增加齲齒的風(fēng)險(xiǎn)。牛奶也具有較強(qiáng)的緩沖能力，牛奶蛋白質(zhì)含量豐富，且含有大量的鈣等無(wú)機(jī)鹽離子，使其具有良好的緩沖能力[14]。

2.2 不同飲料對(duì)雙菌生物膜形成的影響

牙菌斑生物膜的形成是齲病的始動(dòng)因素，變異鏈球菌和白色念珠菌雙菌生物膜的形成量是評(píng)價(jià)飲料致齲性的重要指標(biāo)。由圖2可知，除酸奶外其他飲料的加入都使雙菌形成很強(qiáng)的生物膜，其OD600 nm>3。其中純牛奶使雙菌生物膜形成量最大，其OD600 nm達(dá)到3.47。牛奶中含有豐富的蛋白質(zhì)，可以作為微生物優(yōu)良的氮源，且其pH為中性，適宜微生物旺盛生長(zhǎng)，因而形成了較強(qiáng)的生物膜。牛奶富含營(yíng)養(yǎng)，是兒童家長(zhǎng)傾向于購(gòu)買(mǎi)的飲料，但其致齲能力仍需要結(jié)合脫礦情況和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)以更好的評(píng)價(jià)。而果汁和碳酸飲料pH均為酸性，且雙菌生物膜形成量高，致齲性較強(qiáng)。相比之下，酸奶具有顯著的抑制生物膜形成的效果，這可能由于酸奶發(fā)酵過(guò)程中加入的乳桿菌具有調(diào)節(jié)口腔微生態(tài)的作用，且不同于其他飲料當(dāng)中的檸檬酸，酸奶發(fā)酵過(guò)程產(chǎn)生的乳酸對(duì)致齲菌的生長(zhǎng)可能起到了一定的抑制作用[15]，故形成的生物膜量最低。

圖2 飲料對(duì)雙菌生物膜形成的影響
Fig.2 Effect of beverages on the formation of double bacteria biofilm

2.3 不同飲料對(duì)雙菌群體感應(yīng)系統(tǒng)的影響

牙菌斑生物膜的形成與群體感應(yīng)信號(hào)分子的調(diào)控密切相關(guān)[16]，群體感應(yīng)是細(xì)菌根據(jù)細(xì)胞密度變化來(lái)調(diào)控基因表達(dá)的一種生理行為，其中存在于革蘭氏陰性菌和真菌中的基于AHL的信號(hào)分子[17]和廣泛存在于各微生物種間交流的AI-2的信號(hào)分子在微生物相互交流中起著重要作用[18]。群體感應(yīng)系統(tǒng)參與了大量基因表達(dá)的調(diào)控，包括發(fā)光效應(yīng)、生物膜形成、運(yùn)動(dòng)能力等多種表型[19]，通過(guò)群體感應(yīng)系統(tǒng)可以從另一個(gè)角度反映生物膜的形成。由圖3-a可知，雙菌的上清液中不存在AHL類(lèi)物質(zhì)，沒(méi)有使紫色桿菌呈現(xiàn)紫色光圈。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)著重討論基于AI-2的群體感應(yīng)。

口腔復(fù)雜環(huán)境中通常為多菌共生，不同菌種間通過(guò)信號(hào)分子傳遞信息，相互調(diào)節(jié)[16]，AI-2作為一種種間信號(hào)分子在跨物種間的信息交流中具有重要的意義。哈維氏弧菌發(fā)光現(xiàn)象受到群體感應(yīng)系統(tǒng)的調(diào)控，我們選用了僅能響應(yīng)AI-2調(diào)控的哈維氏弧菌突變株BB170探究不同飲料的群體感應(yīng)現(xiàn)象，測(cè)定了不同飲料對(duì)雙菌群體感應(yīng)信號(hào)分子AI-2活性的影響。結(jié)果表明可樂(lè)、純牛奶、酸奶顯著促進(jìn)了哈維氏弧菌的發(fā)光，即促進(jìn)了雙菌間的AI-2分子的產(chǎn)生，而冰糖雪梨和橙汁則在一定程度上抑制了雙菌間的AI-2分子的產(chǎn)生。與圖2生物膜形成結(jié)果相對(duì)應(yīng)，大部分飲料生物膜的形成與群體感應(yīng)信號(hào)分子的產(chǎn)生呈正相關(guān)，有趣的是，酸奶抑制了雙菌生物膜形成，但并未抑制雙菌間的AI-2分子的產(chǎn)生，這表明酸奶對(duì)生物膜的抑制并非通過(guò)群體感應(yīng)途徑，可能通過(guò)其他調(diào)控機(jī)制進(jìn)行。

a-雙菌的AHL檢測(cè)；b-飲料對(duì)雙菌產(chǎn)AI-2的影響
圖3 群體感應(yīng)檢測(cè)
Fig.3 Quorum sensing detection

2.4 不同飲料對(duì)雙菌產(chǎn)酸的影響

不同飲料使雙菌在培養(yǎng)過(guò)程中pH變化的程度不同。由圖4可知，加入飲料共培養(yǎng)后雙菌上清液有接近的pH值，但由于不同的飲料中含有酸的類(lèi)型和濃度不同，對(duì)口腔致齲菌造成的影響不同，決定了飲料的致齲性。果汁中主要含檸檬酸和抗壞血酸，碳酸飲料主要含碳酸和檸檬酸，而酸奶主要含乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)生的乳酸。DELECRODE等[20]將志愿者口腔中獲得的牙本質(zhì)標(biāo)本暴露在檸檬酸和乳酸中，通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)研究共鑒定出223個(gè)不同的蛋白，其中檸檬酸顯著減少了耐酸蛋白如黏蛋白的含量，乳酸則沒(méi)有，而耐酸蛋白與牙齒穩(wěn)態(tài)保護(hù)作用有關(guān)，因此檸檬酸可能比乳酸具有更強(qiáng)的致齲性。碳酸飲料中的可樂(lè)本身具有最低的pH，在培養(yǎng)過(guò)后使雙菌產(chǎn)酸量更大，這表明，可樂(lè)具有極強(qiáng)的酸蝕能力且可以促進(jìn)菌產(chǎn)酸，具有較強(qiáng)的致齲性。

圖4 雙菌在添加不同飲料培養(yǎng)后的pH
Fig.4 pH value of double-species culture after adding different drinks

2.5 不同飲料對(duì)羥基磷灰石鈣流失率的影響

齲齒的發(fā)生是牙齒脫礦的過(guò)程，脫礦過(guò)程會(huì)伴隨著鈣離子的流失。飲料的酸蝕性可能也會(huì)引起牙齒的脫礦，牙菌斑中的致齲菌本身會(huì)利用蔗糖產(chǎn)酸，其存在也將增加牙本質(zhì)的脫礦[21]。為探究飲料對(duì)致齲菌脫鈣的影響，用羥基磷灰石模擬牙齒，測(cè)定飲料與雙菌共培養(yǎng)后的脫鈣量。由圖5可知，可樂(lè)的脫鈣率顯著高于其他組，這也與圖1-b中反映飲料酸蝕能力的緩沖容量這一指標(biāo)相吻合，酸蝕能力強(qiáng)則脫鈣較嚴(yán)重。

圖5 不同飲料對(duì)唾液包被羥基磷灰石鈣流失率的影響
Fig.5 Effect of different soft drinks on the loss rate of saliva-coated calcium hydroxyapatite

2.6 飲料的特性與致齲性聚類(lèi)熱圖分析

齲齒的發(fā)生是多種因素共同導(dǎo)致的結(jié)果，為全面分析飲料對(duì)齲齒的影響，對(duì)上述測(cè)定的指標(biāo)進(jìn)行了聚類(lèi)熱圖分析(圖6)。在圖6中，顏色越接近紅色，表明飲料對(duì)該特性的影響越強(qiáng)，顏色越接近藍(lán)色，表明飲料對(duì)該特性的影響越弱。從總體上看，碳酸飲料中的可樂(lè)和芬達(dá)具有較強(qiáng)的酸蝕能力和鈣流失率，引起齲齒的風(fēng)險(xiǎn)更大；果汁飲料僅次于碳酸飲料，具有較強(qiáng)的促進(jìn)雙菌生物膜形成的能力，本身也具有較低的pH，酸蝕能力較強(qiáng)；而純牛奶和水本身的pH接近中性，在與雙菌共培養(yǎng)過(guò)程中pH變化最為顯著，在體外牛奶也會(huì)促進(jìn)生物膜形成，這可能由于其豐富的營(yíng)養(yǎng)有利于微生物生長(zhǎng)繁殖；而酸奶本身的pH較低，但卻可以顯著抑制生物膜的形成，鈣流失率也較低，不會(huì)促進(jìn)齲齒的發(fā)生。

圖6 飲料的特性與致齲性聚類(lèi)熱圖分析
Fig.6 Cluster analysis of beverage characteristics and cariogenicity

3 結(jié)論

本研究通過(guò)測(cè)定市售飲料酸度對(duì)變異鏈球菌和白色念珠菌雙菌生物膜形成量的影響、對(duì)雙菌群體感應(yīng)系統(tǒng)的影響，以及對(duì)羥基磷灰石脫礦程度的影響等指標(biāo)來(lái)評(píng)價(jià)飲料對(duì)雙菌的致齲性影響，初步探究了不同飲料的致齲性，對(duì)于同類(lèi)型的飲料，雖pH接近但對(duì)雙菌致齲性影響也有差異，其中可樂(lè)酸蝕能力強(qiáng)且造成牙齒鈣流失率高。本研究為將來(lái)繼續(xù)深入分析飲料的致齲性提供了一定的理論指導(dǎo)，也為兒童飲料的選擇提供了參考。