食用黃花菜SSR標(biāo)記開發(fā)及指紋圖譜庫構(gòu)建

黃花菜俗稱“金針菜”,在植物分類學(xué)上屬百合科萱草屬(Hemerocaliss L.)植物[1]，是一種藥食同源的特色蔬菜，其花蕾可食用，具有豐富的營養(yǎng)價(jià)值，與香菇、木耳、冬筍并稱為“四大素山珍”[2]。據(jù)報(bào)道，黃花菜的揮發(fā)性成分多達(dá)58種[3-4]，含有大量的醇、酯等香氣物質(zhì)，賦予黃花菜特有的美味。近年來有研究表明，食用黃花菜還有抗氧化、抑制纖維原細(xì)胞增生及阻止癌細(xì)胞生殖等作用[5]。

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，DNA 分子標(biāo)記鑒定因快速準(zhǔn)確、不受環(huán)境影響等優(yōu)點(diǎn)逐漸發(fā)揮重要作用，滿足品種快速準(zhǔn)確鑒定和指紋圖譜構(gòu)建的要求[6-7]。其中SSR標(biāo)記具有共顯性、高度重復(fù)性和豐富的多態(tài)性等優(yōu)點(diǎn)，通過PCR快速檢測就能達(dá)到鑒定目的。目前基于SSR分子標(biāo)記的玉米、大豆、小麥、油菜等主要農(nóng)作物的指紋圖譜庫已構(gòu)建完成[7-11]。關(guān)于黃花菜品種DNA指紋圖譜及分子標(biāo)識(shí)研究，陳士林院士[12]針對(duì)藥用黃花菜開展過DNA條形碼分子鑒定研究。

在農(nóng)業(yè)科技迅速發(fā)展和農(nóng)產(chǎn)品市場競爭日趨劇烈的今天,真正的特色農(nóng)產(chǎn)品優(yōu)勢發(fā)揮離不開現(xiàn)代農(nóng)業(yè)技術(shù)。食用黃花菜作為特色加工型農(nóng)產(chǎn)品，利用現(xiàn)代農(nóng)業(yè)技術(shù)快速發(fā)展優(yōu)良種質(zhì)、產(chǎn)地標(biāo)識(shí)及分子身份證構(gòu)建研究已迫在眉睫。本研究擬利用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)開發(fā)黃花菜的SSR標(biāo)記，構(gòu)建黃花菜DNA指紋圖譜庫，預(yù)期研究結(jié)果為食用黃花菜種質(zhì)資源鑒定、評(píng)價(jià)及遺傳多樣性分析提供技術(shù)，進(jìn)一步為品種更新及產(chǎn)業(yè)扶貧提供科技支撐。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

供試43份食用黃花菜種質(zhì)資源由甘肅省農(nóng)科院黃花菜種質(zhì)資源圃提供，種質(zhì)名稱及來源見表1。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 EST-SSR引物設(shè)計(jì)與篩選

采用二代測序技術(shù)對(duì)黃花菜進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，并使用MISA軟件對(duì)所有測序所得的轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行SSR位點(diǎn)搜索。搜索標(biāo)準(zhǔn)為：SSR重復(fù)最低長度為18 bp，單核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸重復(fù)最低次數(shù)為12、6、5、5、4和4次，間隔不完全重復(fù)的SSR位點(diǎn)不列為搜索對(duì)象。結(jié)合SSR位點(diǎn)兩端保守的特點(diǎn)，利用Primer 3.0軟件進(jìn)行批量引物設(shè)計(jì)，共設(shè)計(jì)引物11 363對(duì)，根據(jù)基因注釋分類，挑選出氨基酸代謝和萜類聚酮化合物代謝相關(guān)的Unigene中的SSR引物進(jìn)行合成，共計(jì)89對(duì)。另從文獻(xiàn)中搜索得到25對(duì)萱草屬通用的SSR引物[13-14]，合計(jì)114對(duì)引物進(jìn)行篩選鑒定。

表1 黃花菜種質(zhì)名稱及來源
Table 1 The names and original of Hemerocallis citrina

引物設(shè)計(jì)的原則為EST序列長度大于200 bp，SSR序列的開始和結(jié)束位置分別距5’和3’端不少于20 bp，引物長度18～24 bp，退火溫度Tm值40～60 ℃，上游和下游引物的Tm值相差不大于5 ℃，GC含量40%～60%，且上游和下游引物的GC含量相差不要太大，產(chǎn)物預(yù)期長度100～500 bp。對(duì)各條引物的最佳退火溫度進(jìn)行試驗(yàn)，以每條引物的解鏈溫度(Tm值)為參考，上下各浮動(dòng)5 ℃，通過梯度PCR儀自動(dòng)生成8個(gè)溫度梯度，以擴(kuò)增條帶多且明亮、背景清晰者為最適溫度選擇。

1.2.2 樣品DNA提取

樣品由硅膠顆粒迅速干燥后帶回，每個(gè)樣品取約50 mg，球磨儀研磨后用天根的植物基因組DNA提取試劑盒進(jìn)行樣品DNA的提取，提取完成后用1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行樣品DNA質(zhì)量的檢測，并用超微量分光光度計(jì)測定其濃度和純度，將DNA稀釋至20～50 ng/μL，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 PCR擴(kuò)增

PCR擴(kuò)增體系總反應(yīng)體積15 μL，包括2×Taq Master Mix 7.5 μL，DNase-Free Water 4.5 μL，F(xiàn)orward Primer 1 μL，Reverse Primer 1 μL，模板DNA 1 μL。反應(yīng)程序：95 ℃熱啟動(dòng)3 min，95 ℃變性45 s，48～65 ℃ 退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)后，72 ℃終延伸5 min后結(jié)束。

1.2.4 非變性聚丙烯酰氨凝膠電泳與生物分析儀檢測

利用1.5%的瓊脂糖凝膠和6%的非變性聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行引物的初篩和多態(tài)性篩選，待篩選出核心引物后，使用核心引物對(duì)所有供試材料進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋10倍后上樣至LabChipGx Touch大分子生物分析儀進(jìn)行自動(dòng)化檢測，軟件自動(dòng)收集電泳數(shù)據(jù)。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析

利用Excel軟件統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)，NTSYS軟件的UPGMA進(jìn)行聚類分析。利用 PIC(polymorphism information content)評(píng)價(jià)引物多態(tài)性，PIC計(jì)算如公式(1)所示：

(1)

式中:Pij表示標(biāo)記i的第j個(gè)等位基因在群體中的頻率[15]。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃花菜轉(zhuǎn)錄組SSR位點(diǎn)分布頻率與基序特征

采用Illumina Hiseq技術(shù)，從黃花菜樣品中測序共得到104 177個(gè)Unigene，總長度為79 106 833 bp, 平均長度為759 bp，GC含量為41.99%。利用MISA軟件對(duì)Unigene進(jìn)行搜索，共檢測到15 890個(gè)SSR，分布于12 492個(gè)Unigene，占總序列的11.99%，含有2個(gè)或2個(gè)以上SSR的Unigene有2 545個(gè)，復(fù)合SSR有1 316個(gè)，占總序列的8.28%。從黃花菜EST-SSR中基元分布頻率情況(表2)看，單核苷酸到六核苷酸基元類型均有分布，其中三核苷酸重復(fù)占比最高，為44.26%，二核苷酸和單核苷酸次之，分別為27.23%和18.57%，四、五、六核苷酸占比較低，不足5%。從重復(fù)次數(shù)看, 黃花菜轉(zhuǎn)錄組SSR重復(fù)基序的重復(fù)次數(shù)分布在4～115次, 其中4～8次的SSR個(gè)數(shù)占總數(shù)的69.93%;其次為9～12次的SSR, 共有2 095個(gè), 占總數(shù)的13.18%;13次以上重復(fù)的有 2 699個(gè)，占16.99%(表2)。其中，單核苷酸重復(fù)次數(shù)以≥13次為主，占單核苷酸總重復(fù)次數(shù)的76.37%，二核苷酸重復(fù)次數(shù)主要以6～7次重復(fù)為主，占二核苷酸總重復(fù)次數(shù)的53.78%，三核苷酸重復(fù)中以5～6次重復(fù)為主，占三核苷酸總重復(fù)次數(shù)的72.64%。

從黃花菜基元類型分布圖(圖1)看，單核苷酸重復(fù)基元類型以(A/T)n為主，占單核苷酸重復(fù)總數(shù)的96.387%；二核苷酸重復(fù)基元類型以(AG/CT)n和(AT/AT)n為主，分別占比64.16%和26.25%；三核苷酸重復(fù)基元類型以(AAG/CTT)n和(AGG/CTT)n較多，占比分別為26.87%和15.23%，其余還有8種基元類型，占比從2.55%到10.93%均有分布；四、五、六核苷酸重復(fù)基元類型以(AAAT/ATTT)n、(AAAAT/ATTTT)n和(AACCCT/AGGGTT)n最多。

表2 黃花菜EST-SSR的分布頻率
Table 2 The distribution of the SSR motifs in Hemerocalli scitrina

圖1 黃花菜EST-SSR基元類型分布
Fig.1 The distribution of EST-SSR types in Hemerocallis citrina

2.2 EST-SSR核心引物篩選及多態(tài)性分析

以2份黃花菜種質(zhì)(祁東白花菜和金蕾1號(hào))為材料，采用PCR擴(kuò)增瓊脂糖凝膠電泳檢測，對(duì)114對(duì)SSR引物進(jìn)行初步篩選，共選出擴(kuò)增條帶清晰、目標(biāo)條帶大小相一致的引物70對(duì)，有效引物比率為60.87%；選擇6份不同地方來源的黃花菜作為材料，利用6%非變性聚丙烯酰氨凝膠電泳對(duì)70對(duì)初選引物進(jìn)行多態(tài)性引物篩選，共篩選出條帶清晰、多態(tài)性高、擴(kuò)增穩(wěn)定的引物33對(duì)，多態(tài)性引物擴(kuò)增率為26.09%；進(jìn)一步選用供試43份黃花菜種質(zhì)材料，對(duì)上述篩選出的33對(duì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增、6%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，最終篩選出20對(duì)品種類型間多態(tài)性高、條帶清晰易讀取的SSR引物作為黃花菜指紋圖譜構(gòu)建的核心引物(表3)。20對(duì)引物中二核苷酸重復(fù)4對(duì)，三核苷酸重復(fù)13對(duì)，四、五、六核苷酸重復(fù)各占1對(duì)，重復(fù)次數(shù)主要以5～6次為主。

20對(duì)核心引物的PIC值變幅為0.23～0.77，平均為0.499 5。其中，引物HH42的PIC值最高，HH78的PIC值最低。20對(duì)核心引物中有12對(duì)引物為高度多態(tài)位點(diǎn)(PIC>0.50)，占比60%，7對(duì)引物為中度多態(tài)位點(diǎn)(0.25≤PIC≤0.50)，占比35%，1對(duì)引物為低度多態(tài)位點(diǎn)(PIC<0.25)，占比5%，表明篩選出的20對(duì)核心引物在參試品種間具有豐富的多態(tài)性。

2.3 指紋圖譜庫的構(gòu)建

20對(duì)核心引物對(duì)43份黃花菜種質(zhì)進(jìn)行擴(kuò)增檢測，統(tǒng)計(jì)各黃花菜種質(zhì)在20個(gè)SSR位點(diǎn)上的擴(kuò)增片段大小，用片段大小命名各等位變異，建立包含43份黃花菜種質(zhì)的DNA指紋圖譜庫(表4)，篩選出安民花1號(hào)、祁東四月花、棒槌花、高箭中期花、雪不謝苗、祁東中期花、四川武平旱共7個(gè)黃花菜品種的特異標(biāo)記。在20個(gè)位點(diǎn)中共檢測到88個(gè)等位變異，每個(gè)位點(diǎn)的等位變異數(shù)為3～8個(gè)，平均為4.4個(gè)。

2.4 聚類分析

根據(jù)NTSYS軟件genemic similiarity計(jì)算，43份黃花菜種質(zhì)材料間的遺傳距離變化為0～0.813 8，遺傳相似度變化范圍為0.443 2～1，從聚類圖(圖2)中看出，其中有5組(I-V)材料，每組材料間相似度為1，組內(nèi)無法區(qū)分，分別是：I組為渠縣花、山西大同花、未知2和未知4；II組為淮陽花、沙苑金針和浙江仙居花；III組為祁珍花和未知黃花型；IV組為猛子花、沐陽采集種質(zhì)和金蕾1號(hào)；V組為重慶紅花和龍游紅花菜。除去以上14種種質(zhì)資源，剩余的29份種質(zhì)均可以進(jìn)行區(qū)分，且以上5組材料組間仍然可以進(jìn)行區(qū)分。

表3 20對(duì)EST-SSR引物信息
Table 3 The primer information for 20 pairs of EST-SSR

圖2 43份黃花菜種質(zhì)聚類圖
Fig.2 The cluster analysis dendrogram of 43 varietiesin in Hemerocallis citrine

3 討論

種質(zhì)資源是植物遺傳改良的物質(zhì)基礎(chǔ)，然而，日益龐大的種質(zhì)數(shù)量增加了資源收集保存和遺傳改良工作量，導(dǎo)致工作效率低下[15]。通過分子標(biāo)記鑒定，篩選淘汰同名異物、同物異名的冗余種質(zhì)，提高種質(zhì)資源的鑒定保存效率。與其他分子標(biāo)記相比，SSR 分子標(biāo)記在基因組上分布均勻、數(shù)量豐富、穩(wěn)定性好且技術(shù)成熟，可從DNA水平直接鑒定品種間遺傳差異[16]。國際植物新品種保護(hù)聯(lián)盟把SSR和SNP作為作物品種DNA 指紋庫構(gòu)建的分子標(biāo)記[17]，并已經(jīng)在遺傳多樣性分析、品種鑒定、群體結(jié)構(gòu)及圖譜構(gòu)建等方面得到應(yīng)用[18-20]。李益等[21]利用21對(duì)SSR核心引物，構(gòu)建了包含500份柑橘品種的 DNA 指紋圖譜庫，篩選出部分品種的特異標(biāo)記，可以鑒別221份柑橘品種和87個(gè)品種組合。分子標(biāo)記在黃花菜上的應(yīng)用十分滯后，主要有以下幾方面的進(jìn)展：鄭家禎等[22]利用SCoT分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)28份國內(nèi)栽培的黃花菜資源19個(gè)形態(tài)學(xué)特征進(jìn)行了遺傳多樣性分析，李森等[23]對(duì)85份萱草屬植物開花表型性狀進(jìn)行多樣性分析，黎海利等[24]借助 AFLP標(biāo)記對(duì)35份萱草野生種和栽培品種進(jìn)行親緣關(guān)系研究，但是這些研究很少結(jié)合形態(tài)學(xué)和分子標(biāo)記進(jìn)行比對(duì)分析，且未專門針對(duì)國內(nèi)食用黃花菜的品種資源進(jìn)行分析。

本研究所選的20對(duì)核心引物能將43份地方種質(zhì)中的29份有效區(qū)分，未能區(qū)分開的品種有5組共14個(gè)。通過分析14個(gè)品種的親本、植物學(xué)性狀、來源等相關(guān)信息發(fā)現(xiàn)，這些品種的特征特性較為接近，例如“重慶紅花菜”和“龍游紅花菜”這一組，2個(gè)品種在開花期花朵顏色、大小、葉形等植物學(xué)性狀完全相同。“渠縣花、山西大同花、未知2和未知4”這組可能存在同一個(gè)品種在不同地方因品種名稱不一樣而被重復(fù)收集的情況，也就是同種異名的現(xiàn)象。由于黃花菜育苗仍以農(nóng)民自己傳統(tǒng)育種為主，有些品種可能是在地方品種的基礎(chǔ)上提純復(fù)壯而來，兩者間的遺傳背景一致，因此利用有限數(shù)量的分子標(biāo)記仍難以鑒別。

4 結(jié)論

本研究篩選出20對(duì)擴(kuò)增穩(wěn)定、條帶清晰、多態(tài)性高的核心引物，依據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的片段大小確定了每個(gè)SSR位點(diǎn)的等位變異以及對(duì)應(yīng)的參照品種，建立了基于EST-SSR的DNA指紋鑒定技術(shù)體系，并構(gòu)建了43份黃花菜種質(zhì)的DNA指紋數(shù)據(jù)，可以應(yīng)用于黃花菜種質(zhì)鑒定和遺傳多樣性評(píng)價(jià)。

表4 黃花菜品種基因型數(shù)據(jù)
Table 4 Genotype data of d Hemerocallis citrina

續(xù)表4

續(xù)表4