β-淀粉樣蛋白的聚集及其調(diào)控

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)是最常見的神經(jīng)退行性疾病之一，嚴重威脅著人類的健康，給社會和家庭帶來了沉重的經(jīng)濟負擔。據(jù)統(tǒng)計，世界范圍內(nèi)約有5000萬人受AD的影響，我國約有600萬的AD患者，預計到2050年全世界患病人數(shù)將達1.52億[1]。因此亟需開發(fā)能夠治愈AD的藥物或手段。臨床上，AD患者表現(xiàn)為認知能力的下降、記憶力的衰退、情緒和性格的改變、語言功能障礙等。AD的致病原因較為復雜，各種因素均能誘發(fā)AD，宏觀上有年齡、基因、病毒感染、糖尿病、腦部創(chuàng)傷等因素；微觀層面如Tau蛋白過磷酸化、淀粉樣蛋白(amyloid β-protein, Aβ)的沉積、金屬離子穩(wěn)態(tài)失衡等[2]。其中，Aβ級聯(lián)假說受到了廣泛的研究和認可[3-5]。Aβ級聯(lián)假說認為，細胞外Aβ病理性的沉積是引發(fā)神經(jīng)損傷的關鍵因素。Aβ單體能夠自發(fā)聚集形成纖維狀的聚集體，并在其纖維化的過程中產(chǎn)生大量異質(zhì)的寡聚體。Aβ寡聚體和纖維對神經(jīng)細胞產(chǎn)生嚴重的毒性，導致突觸功能受損，從而引發(fā)功能性障礙。因此，調(diào)控Aβ的聚集已成為治愈AD的關鍵。

近年來，在Aβ聚集及其調(diào)控方面已進行了廣泛的研究[6]，但由于Aβ聚集過程呈現(xiàn)復雜的多尺度性，目前對寡聚體結構的認識尚不充分，因此制約著Aβ聚集抑制劑的開發(fā)。為此本文綜述了以Aβ聚集及其調(diào)控為核心的相關介尺度過程。首先，簡要介紹Aβ的產(chǎn)生和聚集過程以及與介尺度科學的關系。隨后，按照不同的分類標準系統(tǒng)總結Aβ聚集過程中產(chǎn)生的各種介尺度寡聚體，以及Aβ寡聚體的細胞損傷機制。然后，對目前廣泛研究的Aβ抑制劑，如小分子類、多肽類、蛋白類、納米類抑制劑進行歸納和闡述。最后，討論AD治療以及Aβ抑制劑目前存在的挑戰(zhàn)和需要重點研究的方向。本綜述將不僅增強對介尺度結構的共性認識，更為設計有效的Aβ聚集抑制劑乃至治愈AD提供參考。

1 Aβ的產(chǎn)生和聚集過程

Aβ多肽由淀粉樣前體蛋白(Aβ precursor protein, APP)水解切割得到。APP存在于谷氨酸能神經(jīng)元表面，含695~770個氨基酸殘基，在維持突觸可塑性、神經(jīng)元正常的生理功能方面具有重要作用。在淀粉樣生成途徑中，APP經(jīng)β-分泌酶和γ-分泌酶的水解，產(chǎn)生39~43個氨基酸殘基的Aβ片段；而在非淀粉樣生成途徑中，由于APP會經(jīng)α-分泌酶的水解，因此不會產(chǎn)生Aβ片段（圖1）[7]。在大腦內(nèi)，Aβ40占80%~90%，而Aβ42占5%~10%。由于Aβ42比Aβ40多含有2個疏水性的氨基酸，因此，Aβ42具有更高的聚集傾向。此外由Aβ42聚集所產(chǎn)生寡聚體的細胞毒性也比Aβ40大。在正常生理條件下，Aβ能被胰島素降解酶和腦啡肽酶降解；未被降解的Aβ會穿越血腦屏障(blood-brain barrier, BBB)進入循環(huán)系統(tǒng)[8]。Aβ單體具有一定的生理活性，能保護成熟的神經(jīng)元免受興奮性毒性死亡，還能夠調(diào)節(jié)電壓門控鉀通道。但是Aβ一旦發(fā)生聚集，會產(chǎn)生較大的神經(jīng)毒性，誘導神經(jīng)元死亡。

圖1

圖1   Aβ產(chǎn)生和聚集過程中的介尺度科學問題

Fig.1   Schematic illustration of mesoscience in the production and aggregation of Aβ

研究表明，Aβ的聚集過程符合“核依賴聚集動力學”，根據(jù)表征聚集體中β-sheet含量的硫黃素T (thioflavin T, ThT)熒光實驗可將聚集過程分為成核期、生長期和穩(wěn)定期三個階段[9]。聚集始發(fā)于Aβ單體的構象轉(zhuǎn)變。首先是Aβ單體暴露出疏水性的基團，兩個單體之間通過自身識別位點經(jīng)二聚化作用結合到一起，形成反平行β-sheet結構的二聚體(dimer)[10]。二聚體不斷發(fā)生構象的轉(zhuǎn)變，和其他單體或者二聚體通過疏水和氫鍵作用組裝形成亞穩(wěn)態(tài)的寡聚體，并形成“聚集核”，此過程被稱為初級成核(primary nucleation)過程。隨后，以上述形成的“聚集核”作為單體或寡聚體結合的模板，聚集形成大量的原纖維，從而進入聚集加速的生長期。在生長階段，聚集體的β-sheet結構快速增加。最后，進入穩(wěn)定期，形成大量成熟的Aβ纖維[11]。此外，形成的原纖維或者纖維聚集體會斷裂形成新的碎片，這些碎片化的纖維能作為新的“聚集核”，促進Aβ寡聚體的富集并加速Aβ的聚集，此過程被稱為二次成核(secondary nucleation)過程（圖1）。雖然Aβ的纖維化大致符合上述聚集路徑，但是具體聚集的分子機理不僅與Aβ亞型相關,還與初始結構、溶解度等多種因素有關[12]。

上述Aβ聚集反應是包含多種結構的復雜性生物反應過程，屬于介尺度科學的研究范疇。如圖1所示，Aβ的聚集經(jīng)歷了單體的構象轉(zhuǎn)換，多種不同分子量、形態(tài)結構寡聚體的形成，以及最終的成核并生長為纖維的過程。其中單體為單元尺度，核和纖維為系統(tǒng)尺度，而不同的Aβ中間體則是介于單元與系統(tǒng)尺度之間的介尺度[13]。Aβ聚集過程是多種介尺度結構競爭與協(xié)調(diào)共同作用的結果，且Aβ中間體形態(tài)的多樣性、結構的多尺度性以及反應的多變性導致Aβ聚集研究的復雜性[14]。為此，亟需解析蛋白質(zhì)聚集過程中耦合連接的關鍵介尺度結構、闡明Aβ介尺度結構的變化規(guī)律、建立Aβ聚集的介尺度動態(tài)模型，以針對性地調(diào)控關鍵介尺度結構的形成，從而實現(xiàn)Aβ聚集的調(diào)控以及AD治療的目標。

2 介尺度Aβ寡聚體的分類及其性質(zhì)

與其他復雜性系統(tǒng)類似，盡管Aβ聚集過程呈現(xiàn)出不同的層次，但每個層次的邊界尺度上系統(tǒng)的行為相對簡單，易于表征和分析[13]。如聚集的初始條件為在體內(nèi)累積大量的Aβ單體，聚集的最終狀態(tài)是形成富含β-sheet結構的纖維狀Aβ聚集體。而在它們之間的介尺度層次上，系統(tǒng)性行為非常復雜，缺乏成熟的理論描述。因此對于介尺度Aβ寡聚體結構與行為的定量描述與調(diào)控是介尺度科學研究的核心問題，也是耦合Aβ聚集過程多尺度問題的關鍵之處。但目前的實驗手段很難對Aβ聚集過程中介尺度寡聚體結構進行精確的描述，因此難以闡明介尺度結構動態(tài)形成的機理。現(xiàn)階段對介尺度Aβ寡聚體的研究呈現(xiàn)出顯著的跨學科、跨領域特征，目前主要通過生物物理學技術、成像手段、計算機模擬等方法進行模糊的描述，且結果具有很大的局限性。其中常見的分析方法有通過分子量大小進行區(qū)分的SDS-PAGE (SDS-polyacrylamide gel electrophoresis)；根據(jù)Aβ寡聚體半徑大小區(qū)分的尺寸排阻色譜(size-exclusion chromatography, SEC)；成像技術包括電鏡(electron microscopy, EM)、原子力顯微鏡(atomic force microscopy, AFM)成像；結構解析手段包括X射線衍射(X-ray diffraction)、固態(tài)核磁共振技術(solid-state nuclear magnetic resonance techniques, ssNMR)；特異性抗體對寡聚體特定構象的識別等[7]。以下通過分子量、形貌、結構、構象等原則對介尺度Aβ寡聚體進行分類和性質(zhì)總結。

2.1 按分子量分類

按分子量的不同，Aβ寡聚體可分為二聚體、三聚體(trimer)、四聚體(tetramer)等。電泳是區(qū)分不同分子量蛋白質(zhì)聚集體的常規(guī)手段，但由于Aβ寡聚體的亞穩(wěn)態(tài)性，在電泳過程中會發(fā)生Aβ的自組裝，從而影響實驗結果?？赏ㄟ^光誘導蛋白交聯(lián)(photoinduced cross-linking of unmodified proteins, PICUP)技術來穩(wěn)定寡聚體的結構，以終止介尺度寡聚體動態(tài)組裝過程[12]。通過PICUP并隨后電泳后發(fā)現(xiàn)，不同類型的Aβ所組裝形成的寡聚體各不相同：Aβ42能夠形成五聚體(pentamer)、六聚體(hexamer)，進一步會形成類似于原纖維的串珠結構；而Aβ40則會聚集成二聚體、三聚體、四聚體[12]。其中二聚體是毒性寡聚體的基本構件分子，三聚體可以組裝形成分子量為56 kDa的Aβ*56或者Aβ十二聚體(dodecamer)。Aβ42十二聚體能夠進一步組裝形成線性的前原纖維(preprotofibrils)，因此認為Aβ42十二聚體是Aβ42纖維形成的種子[15]。

寡聚體會通過減弱長時程增強過程(long-term potentiation, LTP)來影響記憶。LTP通過長時間強化神經(jīng)信號來促進記憶的形成，因此LTP的減弱常與信號轉(zhuǎn)導以及記憶的衰退有關。研究發(fā)現(xiàn)，來自于7PA2細胞的三聚體能夠減弱LTP。同樣，通過SEC分離AD患者大腦提取物得到的二聚體也能夠衰減LTP，影響大鼠的記憶[7]。在AD轉(zhuǎn)基因小鼠的腦內(nèi)也發(fā)現(xiàn)了Aβ十二聚體，當把分離得到的十二聚體注射入大鼠的腦內(nèi)后，通過水迷宮實驗發(fā)現(xiàn)十二聚體也會導致記憶的下降。雖然二聚體、三聚體、十二聚體中哪種寡聚體的毒性最大有待進一步的探索，但目前一般認為高分子量(high molecular weight, HMW)寡聚體的毒性強于低分子量(low molecular weight, LMW)的寡聚體[16]。

2.2 按形貌、結構分類

介尺度寡聚體按形貌分類可分為球形、環(huán)形等。球形結構的Aβ寡聚體包括Aβ衍生擴散配體(Aβ-derived diffusible ligands, ADDLs)、淀粉樣球體(amylospheroids, ASPDs)、球聚體(globulomers)等。

ADDLs是在AD患者的腦內(nèi)檢測到具有擴散性的球形寡聚體，粒徑5~6 nm，分子量10~100 kDa，可以被ADDLs特異抗體NUx和纖維特異性抗體OC識別[17-18]。ADDLs不僅可以和成熟的神經(jīng)元結合，產(chǎn)生神經(jīng)毒性并誘導神經(jīng)元自噬；還能減少神經(jīng)元上的胰島素受體并影響胰島素的正常信號。此外，ADDLs能夠誘導Tau蛋白過磷酸化并抑制LTP。

ASPDs是粒徑10~15 nm、分子量158~669 kDa的完美球形結構[19]。由商業(yè)化Aβ在體外培養(yǎng)5 h形成。也存在于AD患者的腦內(nèi)，是不參與Aβ纖維形成(off-fibril pathway)的寡聚體。ASPDs不與寡聚體抗體A11和纖維抗體OC產(chǎn)生反應，因此其構象與Aβ二聚體、Aβ十二聚體不同。HMW的ASPDs在神經(jīng)退行的早期階段通過影響Tau蛋白激酶Ⅰ/GSK-3β誘導細胞毒性[20]。近期的研究表明，蛋白酶體抑制會使興奮性神經(jīng)元中的ASPDs水平升高，導致ASPDs從軸突轉(zhuǎn)移至樹突。ASPDs會進一步分泌并結合至附近的Na+/K+-ATPase α3(NAKα3)神經(jīng)元，引起NAKα3神經(jīng)元的死亡[21]。

Globulomers是2005年發(fā)現(xiàn)的一種高度穩(wěn)定的水溶性球形寡聚體，分子量60 kDa[22]。這種寡聚體可以由Aβ與SDS或脂肪酸培養(yǎng)得到，并在AD患者和轉(zhuǎn)基因Tg2576小鼠腦內(nèi)發(fā)現(xiàn)了此種寡聚體。與Aβ纖維不同，Globulomers同時含有平行和反平行的β-sheet結構。其通過減弱LTP，抑制AD患者突觸的活躍度來影響認知[22]。

環(huán)形Aβ原纖維(annular protofibrils, APFs)具有環(huán)形或者孔形的結構，直徑18~25 nm，可以穩(wěn)定數(shù)月，并且能夠被環(huán)形抗原纖維抗體檢測[23]。北極突變型(E22G)Aβ40和野生型Aβ40均可以形成APFs。Aβ42原纖維寡聚體在親水-疏水的界面的作用下也能夠形成APFs。在脂質(zhì)膜的環(huán)境中APFs能夠形成β-桶(β-barrel)狀結構。

盡管研究者對Aβ寡聚體的形貌有初步的了解，但由于Aβ寡聚體的多尺度性、暫態(tài)性和復雜性，原子尺度寡聚體結構的解析還存在較大的困難。通常需要計算機模擬和實驗相結合的方法來確定特定寡聚體的結構[24]。圖2列舉了通過計算機模擬或者結構解析的手段得到的幾種常見的寡聚體結構，包括：二聚體、五聚體、六聚體、Globulomers、β-barrel、環(huán)形孔(annular pore)等[25-27]。

圖2

圖2   Aβ寡聚體的結構[25-27]

Fig.2   Structures of Aβ oligomers[25-27]

2.3 按構象分類

不同介尺度寡聚體的構象各不相同，寡聚體的構象與其生物學效應最為相關，通常利用特異性抗體來識別區(qū)分不同生物功能的寡聚體。常見的抗體有A11、KW1、OC等。

A11抗體能特異性地與可溶性Aβ寡聚體相結合，不與Aβ單體或纖維產(chǎn)生作用[28]。A11也可與其他淀粉樣蛋白所形成的寡聚體結合，如胰島淀粉樣蛋白(islet amyloid polypeptide, IAPP)、α-突觸核蛋白(α‐synuclein)、溶菌酶等。因此，A11抗體能識別特定的寡聚體構象，而與氨基酸序列無關，此構象被認為是蛋白質(zhì)聚集引起細胞毒性的關鍵、通用型的寡聚體構象。

KW1抗體能識別寡聚體中反平行β-sheet結構[29]。研究發(fā)現(xiàn)，KW1能夠與Aβ寡聚體表面的疏水性區(qū)域（如Aβ18-20片段）產(chǎn)生反應。在人的大腦內(nèi)也發(fā)現(xiàn)了KW1陽性的寡聚體，此種寡聚體會導致突觸的功能性障礙。

OC抗體能夠識別可溶性Aβ寡聚體和纖維。其中能與OC作用的寡聚體被稱為纖維寡聚體(fibrillar oligomers)，是因為這些寡聚體的構象與纖維類似，含有平行的β-sheet結構(in-register parallel β-sheet structure)。而與之相反，與A11作用的寡聚體為原纖維寡聚體(prefibrillar oligomers)，其中含有反平行的β-sheet結構(out-of-register anti-parallel β-sheet structure)。由于原纖維寡聚體需要經(jīng)過構象轉(zhuǎn)變才能形成纖維寡聚體，因此纖維寡聚體的聚集速度比原纖維寡聚體快9倍[30]。

3 Aβ寡聚體的細胞損傷機制

雖然Aβ介尺度結構有待進一步解析，其動態(tài)組裝機理尚不明確，但大量的研究表明可溶性Aβ寡聚體具有較高的神經(jīng)毒性，其在AD的發(fā)病中起關鍵作用。由于Aβ寡聚體結構和性質(zhì)以及體內(nèi)環(huán)境的復雜性，寡聚體在細胞層面誘導毒性以及激活神經(jīng)細胞死亡的機理有待進一步明確。目前普遍認為寡聚體通過以下三條途徑對細胞產(chǎn)生損傷[31]：(1)寡聚體與細胞膜和膜受體產(chǎn)生相互作用，引起細胞膜的穿孔和細胞信號通路的改變；(2)寡聚體進入細胞后在細胞內(nèi)積累，影響細胞器的功能和細胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)；(3)寡聚體在細胞間傳播，導致淀粉樣斑塊的形成以及引發(fā)AD病理過程（圖3）。

圖3

圖3   Aβ寡聚體介導的細胞毒性[31]

Fig.3   Cytotoxicity triggered by Aβ oligomers[31]

3.1 Aβ寡聚體與細胞膜和膜受體的相互作用

細胞膜的完整性對于細胞活性的維持至關重要。研究表明，反平行β-sheet構象的Aβ寡聚體與孔蛋白結構相似，因此Aβ寡聚體能夠引起細胞膜的穿孔。并且隨著Aβ的纖維化，穿孔的細胞膜最終完全解體。在轉(zhuǎn)基因Tg2576小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，Aβ二聚體能夠與細胞膜上的脂質(zhì)筏(lipid rafts)產(chǎn)生相互作用并累積，形成局部較高的濃度，促進纖維化過程。由于脂質(zhì)筏由膽固醇、GM1-神經(jīng)節(jié)苷脂、鞘脂和突觸受體組成，是神經(jīng)信號的轉(zhuǎn)導中心，因此Aβ寡聚體在脂質(zhì)筏處的累積不僅會導致細胞的解體，還會干擾信號的轉(zhuǎn)導，導致記憶下降。

此外，Aβ寡聚體能夠與許多受體產(chǎn)生作用，調(diào)控下游信號通路，引起突觸的功能性障礙以及神經(jīng)退化。與Aβ能發(fā)生作用的受體有N-甲基-D-天冬氨酸受體(N‐methyl D‐aspartate receptors, NMDARs)、神經(jīng)生長因子(nerve growth factor, NGF)受體、胰島素受體(insulin receptors)、細胞內(nèi)朊蛋白(cellular prion protein, PrPc)等。

3.2 Aβ寡聚體對細胞內(nèi)過程的影響

胞外的Aβ可通過膜受體或神經(jīng)元的內(nèi)吞作用進入細胞內(nèi)。此外，細胞器膜上APP產(chǎn)生的Aβ也可以直接在胞內(nèi)累積。許多細胞器都是Aβ產(chǎn)生和聚集的位點，如線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、核內(nèi)體、自噬體、溶酶體等。胞內(nèi)Aβ寡聚體能夠引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力的升高、Ca2+穩(wěn)態(tài)失衡、線粒體損傷、蛋白質(zhì)的水解以及細胞的凋亡。

Aβ寡聚體通過激活磷脂酶C的信號使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上Ca2+濃度失衡，導致Ca2+由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)向細胞質(zhì)釋放，隨之激活Caspase 3凋亡通路。Aβ寡聚體與線粒體膜作用，會引起細胞色素C的釋放，啟動凋亡過程。線粒體膜的解聚不僅代表線粒體功能的喪失，呼吸作用受到影響，還與突觸功能異常以及記憶的損傷有關。當Aβ寡聚體與溶酶體作用時，會導致溶酶體膜的透化，增強溶酶體酶的外排，引起細胞凋亡。

3.3 Aβ寡聚體的傳播

來自胞外或胞內(nèi)的Aβ均可通過播種效應(seeding effect)在腦內(nèi)擴散。Aβ寡聚體種子也可以通過細胞到細胞的傳播機制進行擴散，受胞內(nèi)體運輸系統(tǒng)(endosomal trafficking system)的調(diào)控。此外，研究發(fā)現(xiàn)在不同Aβ亞型中，Aβ42傳播性最強。寡聚體細胞到細胞的傳播會導致細胞產(chǎn)生較大溶酶體囊泡，從而影響供體和受體細胞的溶酶體功能。

4 Aβ聚集的調(diào)控

由于Aβ寡聚體是Aβ聚集過程中毒性最高的組分，因此抑制Aβ纖維化、調(diào)控聚集過程中關鍵毒性介尺度結構的形成是減弱神經(jīng)損傷最為有效、直接的途徑。此外，也可通過抑制β-分泌酶的活性來減少Aβ單體的生成，利用胰島素降解酶、腦啡肽酶等清除Aβ單體，或重塑Aβ聚集體等方式來調(diào)控Aβ聚集所產(chǎn)生的毒性，以達到治療AD的目的。由于Aβ介尺度結構和聚集過程的復雜性，目前的調(diào)控/抑制劑雖然能夠減弱細胞毒性，對于其作用和調(diào)控機理的研究還有待進一步深入，以下就常見的調(diào)控/抑制劑包括小分子類、多肽類、蛋白類和納米類調(diào)控/抑制劑等進行介紹和歸納總結[32]。

4.1 小分子類抑制劑

天然小分子抑制劑具有分子量小、Aβ親和性高等優(yōu)點。迄今為止已經(jīng)鑒定了兩類小分子抑制劑：多酚類和非多酚類小分子。多酚類小分子含有一個或多個酚羥基，根據(jù)“π-stacking”理論，多酚類化合物的苯環(huán)可能競爭性地與Aβ的芳香基團發(fā)生作用，類似于三明治式地夾雜在兩個氨基酸苯環(huán)殘基之間，阻止Aβ單體間π-π相互作用。此外，多酚類化合物可能通過疏水性相互作用抑制淀粉樣纖維的生長。常見的多酚類抑制有：茶多酚((-)-Epigallocatechin-3-gallate, EGCG)、白藜蘆醇(Resveratrol)、姜黃素(Curcumin)、巴西木素(Brazilin)、蘇木精(Hematoxylin)等（圖4）。非多酚類小分子包括生物堿、黃酮類、苷類、吩嗪等。

圖4

圖4   調(diào)控Aβ聚集的小分子抑制劑

Fig.4   Small molecules that show the modulation capability of Aβ aggregation

來自于綠茶提取物的EGCG是研究最為廣泛的小分子抑制劑，已進入臨床Ⅲ期試驗。EGCG不僅能抑制Aβ的纖維化，還能夠解聚成熟的Aβ聚集體，使之形成大量無定形、非毒性的Aβ寡聚體[33-34]。當金屬離子（如Cu2+、Zn2+等）存在時，EGCG又能與金屬離子、Aβ形成三元復合物，抑制金屬離子誘導的Aβ聚集，有效緩解Aβ-金屬所引起的細胞毒性[35]。通過等溫滴定量熱(isothermal titration calorimetry, ITC)實驗測定EGCG與不同Aβ片段結合的熱力學參數(shù)后發(fā)現(xiàn)，疏水相互作用和氫鍵結合發(fā)生于Aβ的不同區(qū)域。氫鍵結合主要發(fā)生于Aβ1-16片段，而疏水相互作用主要作用于Aβ17-42片段[36]。此外，分子動力學模擬結果表明，EGCG能夠?qū)⑺肿訌腁β的表面排開，并直接與Aβ產(chǎn)生作用[37]。研究顯示，非極性作用對EGCG-Aβ結合能的貢獻大于71%，而極性作用對其結合的貢獻較小。Aβ中有12個氨基酸殘基均能夠與EGCG產(chǎn)生作用，包括Phe4、Arg5、Phe19、Phe20、Glu22、Lys28、Gly29、Leu34~Gly37、Ile41。非極性相互作用主要由疏水性氨基酸殘基(Phe、Met、Ile)的側(cè)鏈和一些非疏水性氨基酸殘基(Lys28、Gly29)的主鏈提供，而極性相互作用主要由Aβ的主鏈(Gly29、Gly37)提供。Ahmed等[38]進一步利用NMR技術對EGCG重塑Aβ寡聚體的分子機理進行了探究。發(fā)現(xiàn)EGCG對Aβ組裝體的調(diào)控符合Hill-Scatchard模型。當與EGCG結合后，Aβ寡聚體溶劑暴露程度降低。此過程擾亂了Aβ單體與原纖維的接觸，從而阻斷了表面催化的二次成核過程，降低了毒性聚集體的生成。

從中草藥丹參中提取得到的丹參酮(Tashinone)，已廣泛應用于治療心血管、心肌梗死、中風等疾病。研究發(fā)現(xiàn)，丹參酮具有顯著的神經(jīng)保護作用；能夠有效抑制Aβ聚集，解聚成熟的Aβ纖維，并減少Aβ聚集誘導的細胞毒性。對于Ⅱ型糖尿病相關的人胰島淀粉樣多肽(human islet amyloid polypeptide, hIAPP)的聚集，丹參酮也具有較強的抑制作用[39]。

巴西木素(Brazilin)是來源于蘇木(Caesalpinia sappan)的一種天然多酚類化合物，具有Aβ聚集抑制和纖維解聚的雙重性功能。在低濃度下，巴西木素的抑制能力強于EGCG。研究表明，巴西木素能夠?qū)β單體和纖維轉(zhuǎn)變?yōu)闊o定形的聚集體，阻止一次成核和纖維催化的二次成核過程。分子模擬結果顯示，巴西木素能通過疏水和氫鍵作用與Aβ組分結合，抑制其纖維化；并通過氫鍵作用干擾D23~K28分子間鹽橋的形成，進而重塑Aβ纖維[40]。此外，巴西木素還能夠抑制來自于前列腺酸性磷酸酶39肽(prostatic acidic phosphatase, PAP248-286)的聚集，有效降低被HIV感染的風險[41]。與巴西木素的結構類似，另一種來自于蘇木的天然小分子化合物蘇木精(Hematoxylin)，也是有效的Aβ聚集抑制劑[42]。蘇木精能減少聚集過程中β-sheet結構的形成，誘導Aβ形成反平行結構，改變聚集路徑，顯著緩解由Aβ聚集所致的細胞毒性。

小分子類抑制劑雖然能在體外有效抑制Aβ的聚集、解聚Aβ纖維，但小分子類抑制劑的專一性差、體內(nèi)循環(huán)時間短、穩(wěn)定性不足、易被降解和代謝，上述缺點限制了小分子抑制劑的體內(nèi)應用。因此，需要設計適宜的藥物遞送體系，以提高小分子的生物利用度。

4.2 多肽類抑制劑

多肽類抑制劑具有易于合成修飾、生物相容性好、特異性高、分子量小、無免疫原性、理化性質(zhì)簡單、可通過理性設計得到等優(yōu)勢[43]，因此近年來多肽藥物發(fā)展迅速。目前，已有60多種多肽藥物上市，近140種正在進行臨床試驗，至少500種處于臨床前評估階段。Aβ多肽類抑制劑通常來自于Aβ自身序列，或根據(jù)特定原則構建的多肽庫，隨后利用分子對接或者分子動力學模擬的方法進行篩選，并通過試驗的手段驗證得到。此外，還可以對先導肽進行衍生、改造，以得到抑制能力更強、功能性更多的多肽抑制劑（表1）。

表1   基于Aβ核心疏水區(qū)設計的多肽抑制劑總結

Table 1  Summarization of peptide-inhibitors designed from the central hydrophobic core of Aβ

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基于Aβ序列設計的抑制劑，根據(jù)多肽序列的來源或作用區(qū)域可分為Aβ核心疏水區(qū)和C-端結構域。Aβ核心疏水區(qū)在Aβ聚集中發(fā)揮著關鍵作用，被稱為“自識別序列”。由于多肽的纖維化是Aβ單體不斷的自我識別過程，因此來自于Aβ核心疏水區(qū)的序列能夠與Aβ分子中相似的片段結合，從而抑制聚集。為評估Aβ核心疏水片段KLVFF中各氨基酸在抑制Aβ聚集中的作用，Tjernberg等[44]用Ala分別取代了KLVFF序列中的Lys16、Leu17、Phe20，以此設計了短肽抑制劑KLVFF。Soto等[45]發(fā)現(xiàn)，傾向于形成β片層構象的序列能夠促進Aβ的纖維化過程。因此，其將Leu17替換為具有阻斷β片層生成作用的Pro，設計出了β-折疊破壞肽(β-sheet breakers)LPFFD。LPFFD不僅能夠抑制Aβ的聚集，還能夠解聚成熟的Aβ纖維，阻止神經(jīng)細胞的死亡，并且也能抑制體內(nèi)淀粉樣斑塊的形成和沉積。

雖然KLVFF或LVFFA均能通過疏水和氫鍵作用與Aβ結合，但其抑制Aβ纖維化的能力較弱，需要經(jīng)過更進一步的設計和改造來提高抑制能力。通過分析Aβ的疏水核心區(qū)以及附近的氨基酸發(fā)現(xiàn)，疏水核心之后的是帶負電的氨基酸殘基E、D。因此如果在多肽抑制劑LVFFA的末端增加帶正電的氨基酸，將會通過靜電相互作用來加強抑制劑與Aβ的結合。為此引入了帶正電的R、K，設計了七肽抑制劑LVFFARK(LK7)[46]。當LK7與Aβ濃度相同時，能夠抑制68%的ThT熒光強度，此時抑制效果最好。但由于自身的聚集性質(zhì)，進一步增大LK7的濃度反而會導致抑制效果的降低以及明顯的細胞毒性。為提高LK7的抑制能力、解決LK7自聚的問題，Ma等[47]通過首尾環(huán)化的方式設計了環(huán)化LK7(cLK7)。與線性的LK7相比，cLK7具有較高的酶解穩(wěn)定性、較低的細胞毒性。cLK7與Aβ較高的親和性有利于其結合到Aβ單體上，穩(wěn)定Aβ的構象，從而顯著抑制Aβ的纖維化和細胞毒性。

由于AD病因的復雜性，單純的Aβ抑制劑往往很難治愈AD。AD的其他病理學特征如過渡態(tài)金屬離子(Cu2+、Zn2+)紊亂，能夠促進Aβ的聚集，形成毒性更高的聚集體[52-53]。此外，過渡態(tài)金屬離子會催化類芬頓反應(Fenton-like reaction)，生成大量的活性氧自由基(reactive oxygen species, ROS)，對細胞產(chǎn)生氧化損傷[54]。因此，開發(fā)具有金屬螯合能力、Aβ抑制能力的多肽具有重要意義。雙/多功能抑制劑不僅能夠抑制Aβ自身的聚集，還能夠抑制金屬離子介導的聚集和產(chǎn)生的ROS，以及解聚Aβ-金屬復合物。在構建雙/多功能抑制劑方面也有廣泛的研究。如以LK7為基礎，在其C-末端引入具有Cu2+螯合能力的HH，可構建雙功能抑制劑LVFFARKHH[48]；在其N-端分別引入肌肽(carnosine, Car)、三肽RTH，可構建Car-LK7[49]、RTHLVFFARK(L-RK10)[50]等。上述多功能多肽抑制劑不僅具有金屬螯合能力,更重要的是由于親水性基團的引入，降低了LK7的自聚趨勢，提高了其抑制性能。

Aβ具有特定的空間構象，對抑制劑存在明顯的手性選擇和偏好性。因而多肽抑制劑的手性轉(zhuǎn)變是提高抑制效率的有效方式。Liu等[51]對多功能抑制劑L-RK10進行了手性轉(zhuǎn)變，以此設計了D-RK10。與L型相比，D-RK10不僅具有更高的抑制能力,還具有類似的ROS抑制、抗氧化損傷性質(zhì)；此外D-RK10能夠重塑Aβ-Cu2+聚集體，阻止解聚碎片的重聚。

通過環(huán)化、手性轉(zhuǎn)化、引入非天然氨基酸、N-甲基化等方式對多肽抑制劑進行衍生，能夠提高抑制劑的抑制能力、增加其功能性、增強抗蛋白水解能力以及提高BBB滲透性。雖然多肽類抑制劑具有較高的生物相容性和Aβ特異性，但是多肽類抑制劑還存在如下缺點有待克服，如：多肽類抑制劑普遍疏水性較強、易于自聚，由此引起抑制能力的降低以及細胞毒性的升高；多肽類抑制劑抑制效果差、有效作用濃度偏高、體內(nèi)穩(wěn)定性不足、易酶解、半衰期短，因此還需要進一步的優(yōu)化和改進。

4.3 蛋白類抑制劑

存在于人體內(nèi)的天然蛋白質(zhì)可作為分子伴侶，調(diào)控Aβ的聚集和神經(jīng)毒性。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)大量蛋白質(zhì)如：人血清白蛋白(human serum albumin, HSA)、熱休克蛋白(heat shock protein, HSP)、叢生蛋白、甲狀腺素轉(zhuǎn)運蛋白(transthyretin, TTR)、朊蛋白PrPc、溶菌酶(lysozyme, Lys)等均能夠與Aβ產(chǎn)生相互作用。蛋白類抑制劑具有較高的生物相容性、易于修飾的優(yōu)點。

血清白蛋白是血清中含量最豐富的蛋白質(zhì)，通常作為營養(yǎng)分子、代謝物、金屬離子、藥物和其他分子的轉(zhuǎn)運蛋白。根據(jù)來源，可分為HSA和牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)。HSA和BSA的結構較為相似，有76%的序列相似性。美國FDA已批準BSA用于藥物制劑的生產(chǎn)和應用。HSA可以通過疏水口袋以1∶1比例與Aβ結合。此外，HSA含有兩個金屬結合位點，能夠螯合Cu2+、Zn2+等金屬離子，有效抑制金屬離子誘導的Aβ聚集。為提高血清白蛋白的抑制能力，Xie等[55]通過引入負電荷的方法合成了酸化的白蛋白(acidulated BSA, A-BSA)。在與Aβ等摩爾濃度培養(yǎng)時，A-BSA和BSA能分別減少47%和25%的ThT熒光強度。A-BSA能夠更顯著地抑制Aβ纖維化，有效緩解Aβ聚集介導的細胞毒性（圖5）?；诖?，研究者提出了疏水結合-靜電排斥(hydrophobic binding-electrostatic repulsion, HyBER)的機理假說。此假說認為Aβ通過疏水作用結合到A-BSA表面；同時由于Aβ和A-BSA帶同種電荷，對結合到A-BSA表面的Aβ起到靜電排斥作用。上述兩種相反的作用使Aβ維持伸展的結構，而非有利于聚集的β-sheet結構。因此A-BSA能夠調(diào)控Aβ的聚集并改變其細胞毒性。由于白蛋白固有的金屬螯合能力，A-BSA、A-HSA也可以用于調(diào)控Cu2+、Zn2+介導的Aβ聚集和毒性[56-57]。此外，對HSA修飾金屬螯合劑亞氨基二乙酸(iminodiacetic acid, IDA)，可進一步提高HSA的金屬螯合容量，有效抑制高濃度金屬離子所產(chǎn)生的ROS，以及金屬離子誘導的Aβ聚集[58]。

圖5

圖5   A-BSA抑制Aβ聚集[55]

(a) A-BSA合成示意圖;(b) Aβ聚集動力學實驗;(c) Aβ在無或有A-BSA條件下培養(yǎng)24 h的TEM圖片;(d) MTT細胞活性實驗;(e) HyBER假說示意圖

Fig.5   A-BSA inhibits Aβ aggregation[55]

(a) Schematic illustration of the preparation of A-BSA; (b) Aggregation kinetics of Aβ incubated with BSA/A-BSA; (c) TEM images of Aβ incubated (A) without or (B) with A-BSA for 24 h; (d) MTT cell viability of PC-12 cells treated with Aβ and different BSA/A-BSA concentrations; (e) Schematic representation of the HyBER hypothesis

以血清白蛋白為基礎，通過增加表面正電荷也可以增強其抑制效果。Wang等[59]利用BSA表面偶聯(lián)乙二胺的方法制備了堿化的BSA (BSA-B)。研究發(fā)現(xiàn)，在較低濃度條件下，BSA-B表現(xiàn)出高效的抑制能力。堿化修飾增強了BSA與Aβ之間的靜電相互作用，實現(xiàn)了BSA與Aβ結合方式由單位點的疏水結合向多位點的靜電結合轉(zhuǎn)變，從而能夠與不同的Aβ組分產(chǎn)生相互作用，有效抑制Aβ的纖維化過程。對HSA進行堿化修飾也得到了類似的結果。在堿化HSA (HSA-B)基礎上進一步偶聯(lián)Aβ特異性近紅外熒光探針、BBB穿膜肽可制備新型的診療試劑(HSA-BFP)[60]。HSA-BFP不僅能抑制AD線蟲體內(nèi)Aβ的沉積、緩解由聚集引起的癱瘓，還能實現(xiàn)體內(nèi)Aβ斑塊的熒光檢測，是一種多功能Aβ診療劑。

其他的蛋白質(zhì)類抑制劑，也可通過表面化學改性的方式提高抑制能力，或賦予其新的功能。如：對溶菌酶進行堿化修飾會增強其抑制能力[61]；偶聯(lián)IDA，引入了Zn2+螯合性質(zhì)[62]；修飾多功能多肽RK10，實現(xiàn)了對Cu2+介導Aβ聚集的抑制，以及對Cu2+-Aβ聚集體的重塑等[63]。

4.4 納米材料類抑制劑

隨著納米技術的迅速發(fā)展，納米材料的生物醫(yī)學應用受到了廣泛的關注。納米材料具有粒徑小、比表面積較大、易于修飾和改性的特點[64-66]。各類納米材料，包括聚合物納米粒子、金屬納米粒子、2D納米材料、碳納米材料以及功能性納米粒子在抑制Aβ聚集和治療AD方面均有涉及（圖6）?？筛鶕?jù)特定的生理微環(huán)境或藥物作用機制來理性設計不同的納米材料，用于提高藥物的遞送效率、實現(xiàn)疾病的治療。

圖6

圖6   納米材料用于調(diào)控Aβ聚集[46,67-73]

Fig.6   An overview of nanomaterials for modulation of Aβ aggregation[46,67-73]

超分子化合物可用于抑制Aβ聚集。第二代大環(huán)超分子如β-環(huán)糊精(β-cyclodextrins, β-CD)、葫蘆脲等能夠通過疏水腔調(diào)控Aβ的聚集[74]。此外，作為一種優(yōu)良的藥物載體，將疏水性的多肽類抑制劑LK7偶聯(lián)于β-CD上，能顯著提高LK7的溶解性，有效增強抑制效率[75]。以杯芳烴為代表的第三代超分子主體化合物不僅繼承了前兩代的特點，還具有易衍生的優(yōu)勢?；腔紵N(para-sulfonato-calix[n]arene, SC[n]A)是杯芳烴的一種衍生物，可以通過主客體化學與多種氨基酸產(chǎn)生靜電、疏水等相互作用，具備抑制Aβ聚集的潛質(zhì)。Wang等[67]研究了SC[n]A(n=4, 6, 8)對Aβ聚集的影響，發(fā)現(xiàn)抑制作用的強弱為：SC[8]A>SC[6]A>SC[4]A。由于SC[8]A的分子環(huán)最大，其柔性也最大，有利于與Aβ發(fā)生相互作用，因此抑制效果最好。

樹枝狀聚合物是高度支化的高分子納米材料，包括聚酰胺樹枝狀聚合物(polyamidoamine dendrimer, PAMAM)、聚乙烯亞氨樹枝狀聚合物、聚丙烯亞胺樹枝狀聚合物等。在藥物遞送、可控釋放、診斷治療等方面均有應用。為驗證抑制劑通過HyBER機理調(diào)控Aβ聚集的正確性，研究者在5代(G5)羧基化PAMAM的表面偶聯(lián)了疏水性的苯乙胺(phenethylamine, PEA)，合成了帶有負電的疏水性抑制劑(PAMP)[68]，發(fā)現(xiàn)適宜取代度的PAMP具有最佳的抑制效果，能夠通過疏水結合-靜電排斥作用來調(diào)控聚集并緩解細胞毒性。此外，通過研究不同代數(shù)PEA修飾的PAMAM對Aβ聚集的抑制后發(fā)現(xiàn)，高代數(shù)的G5-P、G6-P具有抑制能力，而低代數(shù)的G3-P、G4-P無顯著的抑制作用。因此，疏水基團和負電荷基團需要在空間上滿足一定的范圍才能發(fā)揮HyBER作用。當超過此范圍后，兩種相反的作用力不能使Aβ維持伸展的構象，因而不具有抑制能力[76]。HyBER假說中疏水與靜電作用對抑制效率的影響還可以通過其他聚合物納米粒子進行證明和進一步的探究，如：N-叔丁基丙烯酰胺與丙烯酸通過共聚得到的聚合物納米粒子NP10[69]、姜黃素修飾的透明質(zhì)酸納米粒子(curcumin-hyaluronic acid conjugate, CHA)等[70]。

以納米粒子為載體，將多肽或小分子類抑制劑偶聯(lián)于納米粒子上，可以改善多肽或小分子的水溶性，避免其由于自聚而導致的抑制能力降低以及細胞毒性的升高，增強抑制效果。如將多肽抑制劑LK7偶聯(lián)于粒徑為150 nm的聚乳酸-乙醇酸[poly(lactic-co-glycolic acid), PLGA]納米粒子上，制備多肽功能化的納米粒子LK7@PLGA NPs，有效克服了LK7高濃度條件下自聚的缺點[46]。將LK7負載于新型的2D納米材料黑磷(black phosphorus, BP)片層表面，并修飾聚乙二醇PEG，合成了PEG-LK7穩(wěn)定的BP (PEG-LK7@BP)[71]。在有效防止BP降解的同時，較大的BP片層表面為LK7提供了附著平臺，提高了LK7的局部濃度，有利于LK7通過“多價”作用與Aβ組分結合，增強了LK7對Aβ纖維化的抑制。再比如，將所設計的嵌合肽VVIA-CLPFFD(VCD10)偶聯(lián)于金納米粒子(AuNPs)上，合成VCD10偶聯(lián)的AuNPs (VCD10@AuNPs)。多肽在AuNPs表面上特定的趨向和構象，能夠促進其與Aβ產(chǎn)生相互作用，顯著提升多肽的抑制能力[72]。在0.1 nmol·L-1的濃度下，即可將細胞活性由48%提升至82%。

作為一類親水性聚合物，兩性離子聚合物由于其優(yōu)異的生物相容性而受到重視。常見的兩性離子有聚羧基甜菜堿[poly(carboxybetaine), pCB]、聚磺酸基甜菜堿[poly(sulfobetaine), pSB]等。為改善小分子或多肽抑制劑的藥效，可將其偶聯(lián)于兩性離子聚合物上。Zhao等[73]將姜黃素(Curcumin)修飾于pCB上，合成了姜黃素偶聯(lián)的pCB納米粒子(Cur@pCB)。Cur@pCB自組裝形成粒徑為120~190 nm的納米凝膠。其表面的水化層能穩(wěn)定結合在姜黃素上的Aβ，阻止Aβ構象向β-sheet結構的轉(zhuǎn)變。與游離的姜黃素相比，同濃度的Cur@pCB抑制能力明顯提升。類似地，也可將LK7偶聯(lián)于pCB上，制備多肽修飾的聚合物納米粒子LK7@pCB[77]。通常情況下，抑制劑通過抑制β-sheet結構的生成來降低聚集所誘導的細胞毒性。然而Wang等[78]發(fā)現(xiàn)，將LK7偶聯(lián)于帶有二甲基側(cè)鏈的兩性離子pID(LK7@pID)后，促進了Aβ的聚集，此過程擾亂了正常的Aβ纖維化，生成了大量異質(zhì)的纖維聚集體，因此降低了細胞毒性。

此外，一些碳材料，如石墨烯等可用于檢測Aβ單體、抑制Aβ的聚集。Gao等[79]通過水熱法合成了粒徑為5 nm的超小氮摻雜碳化聚合物點(nitrogen-doped carbonized polymer dots, CPDs)。CPDs不僅能通過靜電吸引、氫鍵結合以及疏水相互作用抑制Aβ的纖維化，減少聚集所產(chǎn)生的毒性。還能在數(shù)秒至數(shù)分鐘的時間尺度內(nèi)快速解聚Aβ纖維。更重要的是，當與Aβ結合后，CPDs表現(xiàn)出紅色熒光增強的性質(zhì)。因此CPDs可用于體內(nèi)Aβ斑塊的成像。體內(nèi)實驗結果表明，CPDs能夠通過清除Aβ斑塊，延長轉(zhuǎn)基因線蟲CL2006的生存壽命，是一種多功能的診療試劑（圖7）。

圖7

圖7   CPDs靶向Aβ聚集的多功能性[79]

(a) CPDs的合成示意圖; (b) CPDs的TEM圖片; (c) 通過ThT熒光實驗測定CPDs抑制Aβ聚集; (d) CPDs快速解聚Aβ纖維; (e) CPDs熒光檢測Aβ纖維; (f) CPDs檢測線蟲體內(nèi)Aβ斑塊; (g) CPDs抑制線蟲體內(nèi)Aβ沉積

Fig.7   The multifunctionality of CPDs targeting Aβ aggregation[79]

(a) Schematic representation of the synthesis of CPDs; (b) TEM image of CPDs; (c) CPDs inhibit Aβ aggregation measured by ThT fluorescence assay; (d) Fast disaggregation of Aβ fibrils by CPDs using a stopped-flow spectrometer; (e) Detection of Aβ fibrils by the fluorescence of CPDs; (f) Imaging Aβ plaques in CL2006 nematodes; (g) CPDs suppress Aβ accumulation in nematodes

除常規(guī)納米材料外，光、超聲等外場響應的功能性納米材料也被用于調(diào)控Aβ的聚集，如光熱納米材料、光氧化納米材料等[80]。納米馬達是一類能夠受外場激發(fā)、在微觀尺度自主運動的納米粒子，已應用于強化化學反應、體內(nèi)藥物的靶向遞送、疾病治療等諸多領域。研究者將多肽抑制劑D-RK10負載于近紅外(near infrared region, NIR)光驅(qū)動的Janus納米馬達上，構建了抑制劑修飾的納米馬達(JNM-I)[81]。在NIR光的照射下，JNM-I通過“自熱泳”力產(chǎn)生顯著的運動。NIR光驅(qū)動的JNM-I能夠增強抑制劑與Aβ組分之間的相互碰撞，顯著提高抑制劑的抑制能力，減輕Aβ聚集導致的毒性，阻止Aβ構象由無規(guī)則卷曲向β-sheet的轉(zhuǎn)變。此外，由于JNM-I的主動運動特性和光熱作用，NIR光也能增強其BBB透過性，這有利于AD藥物的遞送和進一步體內(nèi)應用（圖8）。此研究以納米馬達為載體實現(xiàn)了對Aβ聚集過程的調(diào)控與強化，創(chuàng)造性地將過程強化理論應用于與Aβ聚集相關的介尺度科學的研究。

圖8

圖8   NIR光驅(qū)動的JNM-I用于強化抑制Aβ纖維化[81]

(a) JNM-I通過運動作用增強抑制劑與Aβ組分之間的作用; (b) JNM-I的TEM和能譜圖片; (c) 不同激光強度下MSD隨時間間隔變化的曲線; (d) Aβ聚集體的AFM圖片; (e) 在有或無NIR光照條件下SH-SY5Y細胞與JNM-I培養(yǎng)的MTT細胞活性實驗; (f) Aβ聚集48 h后的CD光譜; (g) NIR驅(qū)動的JNM-I穿透BBB

Fig.8   NIR light-powered JNM-I for intensified inhibition of Aβ fibrillogenesis[81]

(a) Enhancing the interactions between inhibitors and Aβ species by the active motion of JNM-I; (b) TEM image and EDS mapping of JNM-I; (c) Curves of MSD vs time interval at varied laser densities; (d) AFM images of Aβ aggregates; (e) MTT cell viability of SH-SY5Y cell incubated with JNM-I and treated with or without NIR light; (f) CD spectra of Aβ after incubation for 48 h; (g) NIR light-propelled JNM-I to cross BBB

5 結論與展望

隨著人口老齡化的日益加劇，AD已成為醫(yī)學、健康領域重點關注和亟待解決的問題之一。目前臨床上緩解AD認知障礙的藥物主要有4種，包括3種膽堿酯酶抑制劑(Donepezil, Galantamine, Rivastigmine)和1種N-甲基-D-天冬氨酸受體拮抗劑(Memantine)。經(jīng)過多年的研究，以Aβ級聯(lián)假說為基礎的藥物設計已取得了一定的結果，并開發(fā)出了一系列的Aβ抑制劑，有些已經(jīng)獲得FDA的批準或進入臨床實驗階段。如Biogen公司開發(fā)的單抗類藥物Aducanumab在2021年6月獲得了美國FDA的加速審批，成為第一個抗Aβ聚集的藥物[82]。但目前針對Aβ的研究還存在如下缺點，需要在今后的研究中得以解決。

（1）由于AD病因的復雜性，Aβ的聚集只是其中一種因素。其他方面，如過渡態(tài)金屬離子紊亂、Tau蛋白過磷酸化、神經(jīng)炎癥等均是AD的重要病理學特征，在這些方面還應該進行更為廣泛、充分的研究，以針對AD病因設計更為可行的候選藥物。例如：腸道菌群紊亂所誘發(fā)的神經(jīng)炎癥是AD的重要發(fā)病機制，調(diào)控腸道菌群可改變氨基酸衍生物的代謝進而影響免疫細胞的浸潤。為此中國科學家研制了首個靶向腦-腸軸的寡糖類AD藥物GV-971，并于2019年11月獲得國家藥品監(jiān)督管理局的批準在國內(nèi)上市。

（2）對于Aβ聚集的關鍵介尺度結構、介尺度動態(tài)組裝機理以及Aβ聚集的生物學作用的理解和認識還遠遠不足。因此需要通過更為綜合、先進創(chuàng)新的手段解析Aβ寡聚體的基本結構，揭示聚集過程的分子機理，并闡釋其引起細胞損傷的機制。

（3）目前的Aβ抑制劑雖然能阻止Aβ的聚集，但其具體的作用原理還有待更深入的探究，需要針對特定的介尺度結構設計更為專一、高效的抑制劑，實現(xiàn)對聚集的調(diào)控與抑制。此外，抑制劑的BBB透過性、體內(nèi)藥效的評估等方面還應該進行廣泛的研究。

（4）在實際應用中，單純的Aβ抑制劑可能不能取得較好的臨床結果。因此，需要在Aβ抑制劑的基礎上對其進行設計改造，如：診療一體化的設計、多功能設計、可控釋放設計等，以滿足臨床的需要。