乳酸菌對(duì)沙棘汁中酚酸及揮發(fā)性化合物的影響研究

沙棘(Hippophae rhamnoides L.)是胡頹子科、沙棘屬落葉性灌木，廣泛種植于我國(guó)西北地區(qū)。沙棘漿果富含大量天然營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[1]，沙棘果中富含酚類(lèi)化合物、維生素、脂肪酸及植物甾醇等天然營(yíng)養(yǎng)成分[2]。沙棘果還擁有一定的醫(yī)療潛力，具有抗氧化、抗菌、抗病毒等特性[3]；并且對(duì)于一些慢性疾病有著積極作用，例如高脂血癥，2型糖尿病和心血管疾病[4]。然而沙棘果在采摘運(yùn)輸過(guò)程中容易受到機(jī)械損傷，將其加工成果汁、濃縮汁等產(chǎn)品不僅可以方便運(yùn)輸，還可以在一定程度上保留沙棘果中的營(yíng)養(yǎng)成分。目前市場(chǎng)上的沙棘果汁產(chǎn)品的加工方式以添加蔗糖、甜味劑等簡(jiǎn)單的糖酸比調(diào)節(jié)為主。產(chǎn)品附加值不高，且對(duì)消費(fèi)者吸引力不強(qiáng)[5]。

乳酸發(fā)酵被認(rèn)為是一種保持并提高果蔬營(yíng)養(yǎng)價(jià)值及感官特性的加工方法[6]。未經(jīng)加工的沙棘果汁pH為2～2.9，這是由于沙棘汁中含有大量以蘋(píng)果酸為主的有機(jī)酸[7]。而乳酸菌通過(guò)蘋(píng)果酸-乳酸發(fā)酵可以將口感苦澀、具有刺激性酸味的蘋(píng)果酸轉(zhuǎn)化成口感柔和的乳酸[8]。此外，乳酸發(fā)酵還能提高果蔬汁的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，F(xiàn)ENG等[9]研究發(fā)現(xiàn)，乳酸菌發(fā)酵可以顯著提高枸杞汁的抗氧化能力，并且類(lèi)黃酮、酚類(lèi)等化合物也有所增加。ZHANG等[10]研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)植物乳桿菌發(fā)酵的藍(lán)莓汁酚類(lèi)物質(zhì)總量增加了43.42%，花青素含量提高了15.38%，且抗氧化能力也有所提高。PENG等[11]發(fā)現(xiàn)乳酸菌發(fā)酵對(duì)于蘋(píng)果濁汁的香氣成分也有一定的改善。因此本研究選用嗜酸乳桿菌和植物乳桿菌復(fù)配對(duì)沙棘果汁進(jìn)行發(fā)酵，通過(guò)液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用(liquid chromatography-electrospray ionisation-mass spectrometry, LC-ESI-MS)、HPLC、頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(headspace solid-phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry, HS-SPME-GC-MS)等方法對(duì)發(fā)酵前后的酚酸、有機(jī)酸和揮發(fā)性化合物進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)對(duì)發(fā)酵前后的抗氧化性進(jìn)行測(cè)定并與酚酸進(jìn)行相關(guān)性分析，以期為沙棘乳酸菌產(chǎn)品的研制提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑、儀器和設(shè)備

植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌，上海仙農(nóng)生物科技有限公司；3，5-二硝基水楊酸、冰乙酸、無(wú)水醋酸鈉、2,4,6-三吡啶基三嗪(2,4,6-tripyridin-2-yl-1,3,5-triazine, TPTZ)、DPPH、ABTS(均為分析純)，天津市盛奧化學(xué)試劑有限公司；MRS固體培養(yǎng)基，海博生物技術(shù)有限公司；有機(jī)酸及酚酸標(biāo)品(均為色譜級(jí))，上海源葉生物科技有限公司；磷酸、甲醇、甲酸、乙腈、2-辛醇(均為色譜級(jí))，上海麥克林生化科技有限公司。

LC-20A高效液相色譜儀，日本島津公司；8890-7000D氣象色譜三重四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用儀，安捷倫科技有限公司；T9S紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；WSC-S色差儀，上海精密科學(xué)儀器有限公司；Vanquish超高效液相系統(tǒng)、Q exactive高分辨質(zhì)譜系統(tǒng)，賽默飛世爾科技公司。

1.2 發(fā)酵沙棘汁的制備

沙棘購(gòu)自新疆石河子，儲(chǔ)存于(4±0.5) ℃的冷庫(kù)中。挑選成熟完整的沙棘用去離子水清洗以除去灰塵和表面雜質(zhì)。將沙棘果與蒸餾水按料液比1∶1(g∶mL)的比例打漿，然后使用40目篩網(wǎng)過(guò)濾雜質(zhì)。為了給乳酸菌提供生長(zhǎng)所用碳源和適宜的酸堿度，使用白砂糖和無(wú)水Na2CO3(食品級(jí))將可溶性固形物含量和pH分別調(diào)整為10.0和6.0，之后在75 ℃的水浴中巴氏殺菌20 min。將沙棘汁冷卻至25 ℃，將混合乳酸菌粉[m(嗜酸乳桿菌)∶m(植物乳桿菌)=1∶1]與無(wú)菌水以1∶50(g∶mL)的比例混合，此時(shí)活菌數(shù)為1010 CFU/mL，接著從中吸取0.07% (體積分?jǐn)?shù))至沙棘汁中，在37 ℃培養(yǎng)48 h。作為對(duì)照，將未接種菌粉的沙棘汁置于相同的條件下48 h。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組都為3次重復(fù)。

1.3 理化指標(biāo)的測(cè)定

可溶性糖參照NY/T 2742—2015《水果及制品可溶性糖的測(cè)定 3,5-二硝基水楊酸比色法》測(cè)定；總酸參照GB 12456—2021《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中總酸的測(cè)定》pH電位滴定法測(cè)定；有機(jī)酸檢測(cè)方法參照GB 5009.157—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品有機(jī)酸》的規(guī)定對(duì)酒石酸、蘋(píng)果酸、檸檬酸、乳酸進(jìn)行測(cè)定。島津高效液相色譜系統(tǒng)，檢測(cè)器SPD-20A，色譜柱選用CAPECELL PAK MG S5 C18柱，4.6 mm×250 mm,5 μm。

使用色差儀對(duì)沙棘汁的色差進(jìn)行測(cè)定，使用白板和黑板將色差儀進(jìn)行預(yù)熱校準(zhǔn)，隨后稱(chēng)取5 mL的樣品進(jìn)行測(cè)定分析，試驗(yàn)重復(fù)3次，最終結(jié)果取平均值[12]。

1.4 抗氧化能力的測(cè)定

總抗氧化能力用鐵離子還原能力(ferric reducing ability of plasma,FRAP)法[13]測(cè)定；參照文獻(xiàn)[14]的方法測(cè)定DPPH自由基清除活性；ABTS陽(yáng)離子自由基清除活性參照文獻(xiàn)[15]的方法稍加修改后測(cè)定。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 酚酸的測(cè)定[16]

采用LC-ESI-MS分析方法對(duì)樣品中酚酸進(jìn)行定性定量檢測(cè)，具體分析條件和分析方法如下：

色譜條件：色譜系統(tǒng)采用超高效液相系統(tǒng)(Vanquish，Thermo，USA)，根據(jù)化合物的性質(zhì)，采用Waters HSS T3(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)液相色譜柱，進(jìn)樣量2 μL，柱溫40 ℃。流動(dòng)相A(0.1%甲酸-乙腈)，流動(dòng)相B(0.1%甲酸-水)。

梯度洗脫(0～2 min，A相10%，B相90%；2～8 min，A相60%，B相40%；8～12 min，A相10%，B相90%)。

質(zhì)譜條件：質(zhì)譜系統(tǒng)采用美國(guó)Thermo公司的Q exactive高分辨質(zhì)譜檢測(cè)系統(tǒng)，配有電噴霧(ESI)離子源和Xcalibur工作站。采用電噴霧離子源(ESI)，分析物在負(fù)離子同時(shí)掃描下以單離子檢測(cè)(SIM)模式進(jìn)行分析，該模式可以大大提高靈敏度。優(yōu)化的質(zhì)譜分析條件如下：鞘氣40；輔助氣10；離子噴霧電壓+3 000 V；溫度 350 ℃；離子傳輸管溫度320 ℃。

1.6 HS-SPME-GC-MS揮發(fā)性化合物分析[17]

向20 mL頂空瓶中加入1 g NaCl，然后加入5 mL樣本和10 μL 2-辛醇(1 000 μg/L)。為吸附揮發(fā)性化合物，將萃取頭插入40 ℃頂空瓶中40 min。然后，使用帶有HP-innowax (30 m×0.25 mm×0.25 μm)毛細(xì)管柱的GC-MS (Agilent 8890-7000D)分析揮發(fā)性化合物。起始溫度40 ℃，保持2 min，然后以3 ℃/min升至85 ℃，再以1 ℃/min升至105 ℃，然后以3 ℃/min升至180 ℃，最后以10 ℃/min升至230 ℃，保持5 min。與NIST2014和Wiley 8.0數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比較，通過(guò)質(zhì)譜鑒定了樣本中的揮發(fā)性化合物，以2-辛醇為內(nèi)標(biāo)測(cè)定各化合物的量，不考慮揮發(fā)性化合物的回收率和響應(yīng)因素，各種揮發(fā)性化合物定量分析如公式(1)所示：

揮發(fā)性化合物提取量/(g·L-1)=

樣品質(zhì)量

(1)

1.7 數(shù)據(jù)處理

使用Origin 2019b及R軟件進(jìn)行作圖，使用SPSS 25進(jìn)行方差分析，P<0.05表明差異顯著。

2 結(jié)果與討論

2.1 發(fā)酵前后理化指標(biāo)的變化

從表1可看出，乳酸菌在沙棘果汁中生長(zhǎng)良好，由可溶性糖、總酸、活菌數(shù)指標(biāo)的變化可知復(fù)配乳酸菌可以很好地利用果汁中的碳源，對(duì)可溶性糖的利用率達(dá)到了42.4%，而可滴定酸含量增加了92%。據(jù)報(bào)道，乳酸菌對(duì)碳源的利用主要有兩條途徑：通過(guò)糖酵解(EMP)途徑產(chǎn)生乳酸，即乳酸菌在無(wú)氧條件下將碳源分解為丙酮酸，進(jìn)而將丙酮酸還原為乳酸[18]；另一方面乳酸菌還可以通過(guò)蘋(píng)果酸-乳酸(malolactic fermentation,MLF)發(fā)酵途徑將蘋(píng)果酸脫羧形成乳酸，圖1為有機(jī)酸測(cè)定的總離子流色譜圖，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理后得到有機(jī)酸的含量如表1所示。沙棘汁中的蘋(píng)果酸含量為6.45 g/L，發(fā)酵結(jié)束時(shí)的蘋(píng)果酸含量為2.34 g/L，所以乳酸菌在沙棘汁中有良好的蘋(píng)果酸-乳酸轉(zhuǎn)化能力，通過(guò)蘋(píng)果酸-乳酸轉(zhuǎn)化可以將口感酸澀的蘋(píng)果酸轉(zhuǎn)化為柔和的乳酸，豐富了飲料的口感[19]。酒石酸則是水果中一種常見(jiàn)的有機(jī)酸，具有強(qiáng)烈的酸味，在乳酸發(fā)酵過(guò)程中通過(guò)酒石酸脫水酶的作用可以將酒石酸轉(zhuǎn)化為乳酸和CO2，也可以在一定程度上降低果汁中酸澀的口感。檸檬酸含量在發(fā)酵前后則無(wú)顯著差異(P>0.05)。從理化指標(biāo)可以看出，乳酸菌可以很好地改善沙棘汁的口感，并改變沙棘汁中的有機(jī)酸組成，同時(shí)活菌數(shù)也高于輕工標(biāo)準(zhǔn)QB/T 5356—2018《果蔬發(fā)酵汁》中規(guī)定的乳酸菌總數(shù)需>1×105 CFU/mL的要求。為了進(jìn)一步研究復(fù)配乳酸菌發(fā)酵對(duì)沙棘汁的影響，同時(shí)也對(duì)發(fā)酵前后的色差值進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果顯示發(fā)酵前后L*、a*及b*值有顯著差異，L*值的變化可能是因?yàn)槿樗峋脑鲋?，?dǎo)致飲料的濁度增加從而引起L*值的下降，a*、b*在發(fā)酵后有明顯改變，這可能是因?yàn)槿樗峋拇x作用將大分子的酚類(lèi)物質(zhì)分解成小分子物質(zhì)，從而改變了飲料的顏色[20]。

圖1 有機(jī)酸的總離子流色譜圖
Fig.1 Total ion flow chromatogram of organic acids

表1 沙棘汁與發(fā)酵沙棘汁的理化指標(biāo)
Table 1 Physicochemical indexes of sea buckthorn juice and fermented sea buckthorn juice

注：同列不同小寫(xiě)字母表示差異(P<0.05);ND-未檢出(下同)

2.2 抗氧化能力的測(cè)定

水果是抗氧化劑的良好天然食物來(lái)源之一，抗氧化活性可以作為評(píng)價(jià)水果產(chǎn)品質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)之一[21]。對(duì)乳酸菌發(fā)酵前后沙棘汁的抗氧化能力、自由基清除能力進(jìn)行了檢測(cè)，總抗氧化能力結(jié)果如表2所示，發(fā)酵沙棘汁(6.15 mmol/L)顯著(P<0.05)高于沙棘汁(5.56 mmol/L)，發(fā)酵可顯著增強(qiáng)沙棘汁抗氧化能力。DPPH自由基清除活性試驗(yàn)表明，相比于沙棘汁，發(fā)酵沙棘汁(82.2%)的DPPH自由基的清除能力提高了23.98%。ABTS陽(yáng)離子自由基清除實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示乳酸菌發(fā)酵沙棘汁為87.65%和沙棘汁為75.03%。相比未發(fā)酵沙棘汁，發(fā)酵后的沙棘汁ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力提高了16.8%。有研究表明，乳酸菌飲料抗氧化能力的提高可歸因于酚類(lèi)物質(zhì)的變化[22]。為此，在后續(xù)的研究中對(duì)酚酸進(jìn)行了檢測(cè)。

表2 沙棘汁與發(fā)酵沙棘汁的抗氧化能力
Table 2 Antioxidant capacity of sea buckthorn juice and fermented sea buckthorn juice

2.3 發(fā)酵前后的酚酸檢測(cè)結(jié)果

酚酸測(cè)定的總離子流色譜圖如圖2所示，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理得到酚酸的含量，從圖3可以看出，沙棘汁中主要的酚酸為：阿魏酸(36.17%)、香草酸(15.34%)、咖啡酸(12.95%)、沒(méi)食子酸(12.79%)，而乳酸菌發(fā)酵沙棘汁中主要的酚酸分別為：阿魏酸(32.83%)、沒(méi)食子酸(30.9%)、咖啡酸(11.25%)。

圖2 酚酸的總粒子流色譜圖
Fig.2 Total ion flow chromatogram of phenolic acids

發(fā)酵后沒(méi)食子酸和阿魏酸的含量都有顯著增加(P<0.05)，其原因可能是在發(fā)酵過(guò)程中pH下降形成的酸性環(huán)境減緩了酚酸的氧化。乳酸菌水解酶也可以將復(fù)雜的多酚如植物細(xì)胞壁的多酚化合物通過(guò)水解形成小分子化合物的方式釋放出來(lái)，從而增加多酚物質(zhì)的含量[23]。

圖3 沙棘汁與發(fā)酵沙棘汁中酚酸含量的比較
Fig.3 Comparison of phenolic acid content between sea buckthorn juice and fermented sea buckthorn juice 注：不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)

對(duì)酚酸與抗氧化性和色度進(jìn)行了皮爾遜相關(guān)性分析，如圖4所示，其中沒(méi)食子酸、咖啡酸、阿魏酸、肉桂酸及總酚酸與DPPH自由基、ABTS陽(yáng)離子自由基的清除能力呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，而與FRAP抗氧化能力呈顯著正相關(guān)的酚酸為沒(méi)食子酸、阿魏酸、肉桂酸及總酚酸。沒(méi)食子酸和阿魏酸是一種常見(jiàn)的抗氧化劑，還具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤等病理作用，對(duì)心血管疾病也有一定的治療作用[24]。乳酸菌發(fā)酵對(duì)于咖啡酸的含量并沒(méi)有顯著影響。香草酸、丁香酸、對(duì)羥基苯甲酸，水楊酸在發(fā)酵之后略有減少。這可能是由于乳酸菌代謝使得不穩(wěn)定的酚酸轉(zhuǎn)化成了其他物質(zhì)。而發(fā)酵后沒(méi)食子酸及阿魏酸顯著增加(其中沒(méi)食子酸較發(fā)酵前增加了183%)，這可能是發(fā)酵后DPPH自由基、ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力及FRAP抗氧化能力增加的原因之一。而對(duì)色度與酚酸的相關(guān)性分析結(jié)果顯示，所有酚酸均與L*、a*、b*的變化呈顯著(P<0.05)相關(guān)，這說(shuō)明發(fā)酵之后酚酸成分的變化是造成顏色改變的重要原因之一。

圖4 酚酸與抗氧化能力及色度的相關(guān)性分析
Fig.4 Correlation analysis of phenolic acid with antioxidant activity and chromaticity

2.4 發(fā)酵前后揮發(fā)性化合物測(cè)定結(jié)果

本研究共鑒定出了41種揮發(fā)性化合物(其中沙棘汁32種，發(fā)酵沙棘汁36種)，包括29種酯類(lèi)化合物、5種醛類(lèi)化合物、3種醇類(lèi)化合物、3種酮類(lèi)化合物及1種酸類(lèi)化合物。從圖5可知，3組平行試驗(yàn)之間差異不大，這說(shuō)明實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性較好，同時(shí)發(fā)酵前后揮發(fā)性化合物成分差異較大且發(fā)酵后揮發(fā)性化合物濃度顯著增加。為了研究發(fā)酵前后香氣成分的差異，通過(guò)對(duì)化合物的濃度與嗅聞閾值的比值對(duì)香氣活度值(odor activity value,OAV)進(jìn)行計(jì)算，OAV≥1的揮發(fā)性化合物被認(rèn)為對(duì)風(fēng)味具有貢獻(xiàn)，發(fā)酵前的沙棘汁中共2種OAV≥1的化合物，分別為：異戊酸乙酯(類(lèi)似蘋(píng)果、香蕉的香氣和酸甜氣味，OAV=23.38)、正己酸乙酯(水果香氣，OAV=4.30)，發(fā)酵后的沙棘汁中共5種OAV值≥1的化合物，它們分別為：丁酸乙酯(菠蘿香味，OAV=7.13)、異戊酸乙酯(OAV=29.08)、正己酸乙酯(OAV=6.19)、異戊酸異戊酯(水果香氣，OAV=1.23)、月桂酸乙酯(花生香氣，OAV=1.20)。乳酸菌發(fā)酵一定程度上改善了沙棘汁的風(fēng)味；為了進(jìn)一步分析發(fā)酵前后揮發(fā)性化合物的變化，以揮發(fā)性化合物濃度為指標(biāo)，使用正交偏最小二乘法判別分析(discriminant analysis of orthogonal partial least squares, OPLS-DA)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理[25]。

圖5 沙棘汁和發(fā)酵沙棘汁的揮發(fā)性化合物含量熱圖
Fig.5 Heat map of volatile compounds content in sea buckthorn juice and fermented sea buckthorn juice

如圖6所示，OPLS-DA模型的為0.973，這表明97.3%數(shù)據(jù)的變化可被模型所解釋?zhuān)?span id="hsbq1k0" class="emphasis_italic" style="font-style: italic;">Q2為0.999，這表明模型的預(yù)測(cè)性良好。如雙標(biāo)圖所示，1～3為沙棘汁，4～6為發(fā)酵沙棘汁。A1～A29為酯類(lèi)化合物，B1～B5為醛類(lèi)化合物，C1～C3為醇類(lèi)化合物，E1為酸類(lèi)化合物，F(xiàn)1～F3為酮類(lèi)化合物。揮發(fā)性化合物在圖中明顯地區(qū)分開(kāi)，這說(shuō)明乳酸菌發(fā)酵對(duì)沙棘汁的揮發(fā)性成分有較大影響。大部分揮發(fā)性化合物與發(fā)酵沙棘汁組的距離較近，這說(shuō)明大部分揮發(fā)性化合物在發(fā)酵后都有所增加，且與發(fā)酵沙棘汁有更為緊密的聯(lián)系。結(jié)果表明乳酸菌發(fā)酵可以顯著增加沙棘汁中揮發(fā)性化合物的濃度及豐富揮發(fā)性化合物的成分。

圖6 沙棘汁與發(fā)酵沙棘汁的OPLS-DA雙圖
Fig.6 Biplot of OPLS-DA in sea buckthorn juice and fermented sea buckthorn juice

3 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，乳酸菌在沙棘汁中生長(zhǎng)良好，可以有效地利用沙棘汁中的碳源，并且具有良好的蘋(píng)果酸-乳酸轉(zhuǎn)化能力。發(fā)酵顯著增強(qiáng)了沙棘汁的抗氧化能力，在未發(fā)酵及發(fā)酵沙棘汁中共鑒定出8種酚酸，發(fā)酵前后含量變化最大的酚酸是沒(méi)食子酸，結(jié)合皮爾遜相關(guān)性分析，這可能是抗氧化能力增加的原因之一。乳酸菌發(fā)酵可顯著增加沙棘汁中揮發(fā)性化合物的含量，且發(fā)酵前后揮發(fā)性化合物成分差異較大。綜合來(lái)說(shuō)，乳酸菌可以通過(guò)改變有機(jī)酸成分達(dá)到改善沙棘汁酸澀口感的功效，同時(shí)還可以起增強(qiáng)抗氧化能力、增加揮發(fā)性化合物濃度及改變揮發(fā)性化合物成分等作用。有效地增強(qiáng)沙棘汁的品質(zhì)，豐富沙棘類(lèi)產(chǎn)品，從而起到提高沙棘產(chǎn)業(yè)產(chǎn)品附加值的作用。