醬油渣源副干酪乳桿菌體外安全性評價

醬油是我國傳統(tǒng)的調(diào)味品，據(jù)智研咨詢發(fā)布的《2021—2027年中國醬油行業(yè)發(fā)展現(xiàn)狀及發(fā)展趨勢預(yù)測報告》中報道，2020年中國醬油產(chǎn)量達700.8萬t。醬油渣是醬油釀造過程中的副產(chǎn)物，每生產(chǎn)1 kg醬油產(chǎn)生含水約75%的醬油渣0.67 kg[1]，即每年產(chǎn)生的醬油渣會超過469萬t，而醬油渣中含有20%～30%的粗蛋白，23%左右的粗纖維，10%以上的碳水化合物等，若處理不當(dāng)是資源的巨大浪費，也會對環(huán)境造成一定程度的污染。因此，對醬油渣的處理及利用是醬油工業(yè)發(fā)展中急需解決的問題之一。近年來，醬油渣的開發(fā)和應(yīng)用較多，如用作動物飼料、制備生物絮凝劑、提取生物活性化合物等，也有通過接種特定微生物，再次發(fā)酵醬油渣，以有效降解原料中潛在有害物質(zhì)，且轉(zhuǎn)化大量基質(zhì)為有用產(chǎn)品，進而改善醬油渣品質(zhì)的研究[2]。

副干酪乳桿菌是乳桿菌屬中的干酪乳桿菌群，廣泛存在于發(fā)酵食品和人的口腔及腸道內(nèi)，在食品、醫(yī)療保健領(lǐng)域發(fā)揮重要作用，特別是其作為商業(yè)發(fā)酵劑具有良好的發(fā)酵特性和研究價值[3]。如：POVEDA等[4]利用副干酪乳桿菌發(fā)酵奶酪，可促使奶酪中游離脂肪酸和醇類物質(zhì)增加，風(fēng)味有明顯提升。也有研究認為，部分副干酪乳桿菌具有一定致病性，能引起敗血癥、心內(nèi)膜炎和局部感染等疾病[5]。由此可見，若副干酪乳桿菌作為發(fā)酵劑使用于食品，則對其進行生物安全性評價與研究尤為必要。

本實驗室前期從醬油渣中分離鑒定得到6株副干酪乳桿菌，這些菌株具有良好的生長及抗氧化特性[6-7]，但尚不了解其生物安全性。因此，本研究擬通過藥敏實驗、質(zhì)粒提取實驗、吲哚實驗、溶血實驗、氨基酸脫羧酶實驗等，對已分離得到的上述6株菌的體外生物安全性進行分析與評價，以充分挖掘利用醬油渣中的副干酪乳桿菌資源，以期為減少醬油渣資源浪費、再次應(yīng)用于醬油渣發(fā)酵或飼料生產(chǎn)等提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗菌株：副干酪乳桿菌HT31、HT90、HT111、HT155、HT159、HT197，均為本實驗室前期從醬油渣中分離得到。標準菌株：金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) ATCC 25923，南京茂捷微生物科技有限公司，大腸桿菌(Escherichia coli) ATCC 25922，上海魯傲科技有限公司。

質(zhì)粒小提試劑盒，天根生化科技有限公司；哥倫比亞血平板、氨基酸脫羧酶對照生化鑒定管、精氨酸脫羧酶、賴氨酸脫羧酶生化管、鳥氨酸脫羧酶生化管、靛基質(zhì)試劑，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；藥敏紙片(青霉素、頭孢唑林、環(huán)丙沙星、紅霉素、慶大霉素、復(fù)方新諾明、氯霉素)，杭州微生物試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ME104電子分析天平，梅特勒-托利多精密儀器公司；ALLEGRA-64R臺式高速冷凍離心機，美國貝克曼庫爾特有限公司；721BR 16103凝膠成像系統(tǒng)，美國 Bio-Rad 公司；GR60DA全自動滅菌鍋，致微(廈門)儀器有限公司；SW-CJ-1FD超凈工作臺，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；LRH-150恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；DYY-7C凝膠電泳儀，北京六一生物科技有限公司；428830數(shù)顯式游標卡尺，寧波長城精工實業(yè)有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 副干酪乳桿菌菌液的制備

將6株副干酪乳桿菌接種于預(yù)先配制好并滅菌的MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，活化3代后待用。

1.3.2 藥敏試驗

根據(jù)文獻[8]和[9]的方法并進行適當(dāng)修改。使用藥敏紙片瓊脂擴散法進行藥敏實驗。使用的藥敏紙片種類為青霉素、頭孢唑林、環(huán)丙沙星、紅霉素、慶大霉素、復(fù)方新諾明、氯霉素，共計7種。將活化至3代的副干酪乳桿菌用無菌生理鹽水稀釋，涂布于MRS培養(yǎng)基，靜置5 min后將相應(yīng)的藥敏紙片貼在培養(yǎng)基上，每個培養(yǎng)基貼2種藥敏紙片，每種藥敏紙片設(shè)3組平行，并以S. aureus ATCC 25923作為質(zhì)控菌株。用游標卡尺測量各藥敏紙片的抑菌圈直徑，根據(jù)《抗微生物藥物敏感性試驗執(zhí)行標準》評價菌株對抗生素的敏感度(表1)。

表1 藥敏實驗判斷標準[10]
Table 1 Criteria for drug sensitivity test

注：S-敏感；I-中度敏感；R-耐藥

1.3.3 質(zhì)粒提取實驗

根據(jù)文獻[11]的方法并進行適當(dāng)修改。取2 mL活化3代后的副干酪乳桿菌菌液，使用質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒。吸取2.5 μL的質(zhì)粒提取液加入0.5 μL 6×Loading Buffer，吹打均勻，吸取混合物3 μL點樣于1%瓊脂糖凝膠孔道中進行電泳實驗。電泳結(jié)束后，用凝膠成像系統(tǒng)對瓊脂糖凝膠進行觀察和分析，以含有pET28a的質(zhì)粒作為陽性對照。

1.3.4 溶血實驗

根據(jù)文獻[12]和[13]的方法并進行適當(dāng)修改。在無菌條件下，將活化3代后的副干酪乳桿菌菌液用滅菌的接種環(huán)劃線于哥倫比亞血瓊脂平板中，培養(yǎng)后觀察有無溶血圈出現(xiàn)，同時用S. aureus ATCC 25923作為陽性對照菌株。若菌落周圍的瓊脂為棕綠色，為α-溶血；若在菌落周圍形成透明圈，為β-溶血；若對溶血無作用，為γ-溶血。

1.3.5 吲哚實驗

參考文獻[11]方法進行。將活化3代后的副干酪乳桿菌接種于蛋白胨水培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h，向培養(yǎng)基中滴加5～8滴靛基質(zhì)試劑并輕搖試管，觀察液面顏色變化。若液面呈現(xiàn)紅色，則為陽性，否則為陰性。以E. coli ATCC 25922為陽性對照菌株，未接種的蛋白胨水培養(yǎng)基為空白對照。

1.3.6 氨基酸脫羧酶實驗

參考文獻[11]方法進行。將活化3代后的副干酪乳桿菌接種于精氨酸、賴氨酸、鳥氨酸脫羧酶實驗管和氨基酸脫羧酶對照管中，滴加無菌液體石蠟封口，于37 ℃培養(yǎng)24 h后觀察管內(nèi)顏色。若賴氨酸、鳥氨酸脫羧酶實驗管與對照管均呈黃色則為陰性，實驗管呈黃綠色且對照管呈黃色則為陽性；若精氨酸脫羧酶實驗管與對照管均呈黃色則為陰性，實驗管變藍綠色且對照管變黃為陽性。以E. coli ATCC 25922為陽性對照菌株。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS 25.0中一般線性模型的單變量分析，對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計處理和差異顯著性分析，數(shù)據(jù)的表示方式為：平均值±標準偏差(x±SD；n=3)。

2 結(jié)果與分析

2.1 耐藥性檢測與分析

2.1.1 藥敏實驗結(jié)果與分析

抗生素耐藥性檢測是乳酸菌安全性評價較為重要的部分。有部分學(xué)者認為，乳酸菌具有一定的耐藥性會產(chǎn)生積極的影響，表現(xiàn)在當(dāng)人或動物使用抗生素治療時可以避免菌體自身被殺滅，同時可幫助宿主恢復(fù)腸道菌群平衡[14]。但當(dāng)乳酸菌具有潛在致病性時，一旦成為致病原，它們所具有的耐藥性則會給治療帶來麻煩，這也是微生物抗生素耐藥性成為全球化問題的原因之一。

藥敏實驗的抑菌圈直徑及結(jié)果如表2所示。根據(jù)藥敏試驗判斷標準可知，對照菌株金黃色葡萄球菌對7種抗生素敏感；6株副干酪乳桿菌對青霉素、頭孢噻吩、紅霉素、氯霉素敏感，對慶大霉素、復(fù)方新諾明不敏感；HT111對環(huán)丙沙星敏感，其他菌株對環(huán)丙沙星中度敏感。董春陽[9]進行的3株副干酪乳桿菌藥敏實驗顯示，所有菌均對青霉素、頭孢噻吩、氯霉素、紅霉素敏感，對慶大霉素不敏感，綜合兩項研究，一致的結(jié)果是，副干酪乳桿菌對青霉素、頭孢噻吩、紅霉素、氯霉素敏感，對慶大霉素不敏感，原因可能是青霉素、頭孢噻吩可以抑制副干酪乳桿菌細胞壁合成酶的產(chǎn)生，進而破壞細胞壁，引起溶菌，使細菌裂解死亡[15]；氯霉素、紅霉素則可通過終止50S亞基與肽?；?tRNA的結(jié)合來阻斷肽鏈的延伸，從而抑制細菌內(nèi)蛋白質(zhì)的合成[16]；大多數(shù)乳桿菌普遍對氨基糖苷類抗生素(如慶大霉素)不敏感，可能是因為副干酪乳桿菌可以產(chǎn)生某種酶使抗生素分子滅活或鈍化從而抗藥，或副干酪乳桿菌能夠增加抗生素外排轉(zhuǎn)運體數(shù)量和改變細胞膜通透性[17]。

6株副干酪乳桿菌對同一種抗生素敏感性有所差異，如表2所示。6株副干酪乳桿菌對青霉素、頭孢噻吩、環(huán)丙沙星、慶大霉素、氯霉素的耐藥性均呈顯著差異(P<0.05)，對紅霉素、復(fù)方新諾明的耐藥性則無顯著差異(P>0.05)。青霉素對HT31的抑制效果最強，對HT155、HT197的抑制效果最弱，且青霉素對金黃色葡萄球菌的抑制效果與HT155、HT197呈顯著性差異(P<0.05)；頭孢噻吩對HT31的抑制效果最強，對HT155、HT159的抑制效果次之，對HT90、HT111、HT197的抑制效果最弱，且頭孢噻吩對金黃色葡萄球菌的抑制效果與HT90、HT111、HT197呈顯著性差異(P<0.05)；環(huán)丙沙星對HT111的抑制效果最強，對HT159的抑制效果次之，對HT31、HT90、HT155、HT197的抑制效果最弱，且環(huán)丙沙星對金黃色葡萄球菌的抑制效果與6株菌均呈顯著性差異(P<0.05)；慶大霉素對HT90的抑制效果最強，對HT31、HT159、HT197的抑制效果次之，對HT111、HT155的抑制效果最弱，且慶大霉素對金黃色葡萄球菌的抑制效果與6株菌均呈顯著性差異(P<0.05)；氯霉素對HT90、HT111、HT155、HT159、HT197的抑制效果最強，對HT31的抑制效果最弱，且氯霉素對金黃色葡萄球菌的抑制效果與HT31無顯著性差異(P>0.05)。

表2 藥敏實驗判斷結(jié)果及不同菌株同一抗生素的耐藥性分析
Table 2 Results of drug sensitivity test and analysis of drug resistance of different strains to the same antibiotic

注：括號內(nèi)字母為耐藥性判斷結(jié)果，S-敏感；I-中度敏感；R-耐藥；藥敏紙片直徑為6.35 mm

7種抗生素對同一菌株的敏感性亦有不同(表3)。紅霉素對6株菌的抑制效果最強，慶大霉素、復(fù)方新諾明對6株菌的抑制效果最弱。此外，青霉素、頭孢噻吩、紅霉素對HT31和青霉素、紅霉素對HT111的抑制效果無顯著差異(P>0.05)，說明青霉素、頭孢噻吩、紅霉素對HT31和青霉素、紅霉素對HT111的抑制效果均為最強的，原因可能是青霉素、頭孢噻吩、紅霉素影響了HT31、HT111內(nèi)蛋白類物質(zhì)的合成[15]。復(fù)方新諾明、頭孢噻吩對對照菌株的抑制效果最強，氯霉素、慶大霉素對對照菌株的抑制效果最弱。

表3 不同抗生素同一菌株的耐藥性分析
Table 3 Analysis of drug resistance of the same strain with different antibiotics

2.1.2 質(zhì)粒提取實驗結(jié)果與分析

耐藥基因通常由質(zhì)粒等可移動的遺傳元件攜帶，它們可以不受種屬間障礙的影響進行自由交換，從而導(dǎo)致耐藥基因水平轉(zhuǎn)移。研究表明，體外培養(yǎng)條件下耐藥基因可以在不同種屬的乳酸菌菌株中發(fā)生轉(zhuǎn)移，當(dāng)外源性乳酸菌作用于腸道時，其耐藥基因能以各種方式在腸道菌群間相互傳遞，進而使致病菌獲得耐藥性，危害宿主健康。此外，若乳酸菌的耐藥基因存在于可轉(zhuǎn)移的質(zhì)粒上，會使乳酸菌的耐藥基因轉(zhuǎn)移到人體基因組，通過基因表達對人體造成潛在危害[18]。

瓊脂糖凝膠電泳實驗結(jié)果見圖1，對照組所在泳道出現(xiàn)熒光條帶(泳道2)，而6株副干酪乳桿菌的泳道上均無條帶出現(xiàn)(泳道3～8)，表明這6株菌均沒有攜帶耐藥基因的質(zhì)粒存在，故可初步判斷這6株菌是安全菌株。該結(jié)果與田原等[19]的副干酪乳桿菌質(zhì)粒提取實驗結(jié)果一致。

1-15 K DNA Marker；2-陽性對照；3～8-副干酪乳桿菌 HT31、HT90、HT111、HT155、HT159、HT197
圖1 質(zhì)粒提取電泳圖
Fig.1 Plasmid extraction electrophoresis

2.2 有害代謝產(chǎn)物評價

2.2.1 吲哚實驗結(jié)果與分析

吲哚實驗可檢測菌株能否產(chǎn)生色氨酸酶，其分解色氨酸后能生成吲哚。色氨酸是人體必需氨基酸，其代謝失調(diào)會影響色氨酸的吸收，甚至影響免疫及消化功能，引起神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙等。

吲哚實驗結(jié)果見表4。6株副干酪乳桿菌的吲哚實驗結(jié)果均為陰性，而對照菌株大腸桿菌的結(jié)果為陽性，說明6株副干酪乳桿菌不能產(chǎn)生色氨酸酶，不會引起吲哚類物質(zhì)的產(chǎn)生。這與王英等[20]的副干酪乳桿菌的吲哚實驗結(jié)果一致。

2.2.2 溶血實驗結(jié)果與分析

溶血是指細菌分泌的溶血素使細胞溶解的現(xiàn)象，與菌株自身致病性相關(guān)。許多革蘭氏陽性菌和陰性菌都能產(chǎn)生溶血素，作用于細胞膜后造成其結(jié)構(gòu)和功能紊亂，使細胞內(nèi)成分泄露，從而導(dǎo)致細胞死亡。根據(jù)溶血情況可分為3類：α-溶血，是指血平板菌落周圍呈現(xiàn)棕綠色，這類菌通常為條件致病菌；β-溶血，是指菌落周圍出現(xiàn)無色透明圈，這類菌通常具有強致病性，如金黃色葡萄球菌；γ-溶血，是指菌落周圍顯示正常血平板顏色，這類菌通常沒有致病性[21]。

溶血實驗結(jié)果見圖2和表4。6株副干酪乳桿菌均有溶血性，其中表現(xiàn)為輕微溶血的菌株有2株，分別是HT31和HT111。副干酪乳桿菌HT197為無色透明圈的β-溶血，被攝入人體后可能有產(chǎn)生敗血癥的風(fēng)險，因此，不能作為發(fā)酵菌株。乳酸菌出現(xiàn)β-溶血的情況較少，此前IBRAHIM等[22]在埃及發(fā)酵乳制品中分離的乳酸菌中也發(fā)現(xiàn)了1株乳酸菌為β-溶血。副干酪乳桿菌HT31、HT90、HT111、HT155、HT159均為呈棕綠色溶血圈的α-溶血，乳酸菌產(chǎn)生α-溶血的情況比較常見，BIN等[23]從多個發(fā)酵乳及牛乳中分離的乳酸菌中有30%的菌株出現(xiàn)了α-溶血，MARAGKOUDAKIS等[24]對干酪乳桿菌和副干酪乳桿菌的溶血實驗研究發(fā)現(xiàn)小部分菌株會出現(xiàn)α-溶血現(xiàn)象，因其沒有出現(xiàn)致病性高的β-溶血，故上述研究者認為這類菌株是相對安全的。由此可以得出，本實驗中出現(xiàn)α-溶血的HT31、HT90、HT111、HT155、HT159均相對安全。

表4 實驗菌與對照菌的有害代謝產(chǎn)物評價結(jié)果
Table 4 Evaluation results of harmful metabolites of experimental and control bacteria

注：--陰性；+-陽性，+的數(shù)量表示程度；/-沒有進行該實驗

a-HT31；b-HT197；c-S.aureus ATCC 25923
圖2 溶血實驗結(jié)果圖
Fig.2 The results of hemolysis test

2.2.3 氨基酸脫羧酶實驗結(jié)果與分析

氨基酸脫羧酶實驗可以檢測菌株分解氨基酸生成生物胺的能力。精氨酸、賴氨酸和鳥氨酸經(jīng)過氨基酸脫羧酶作用后分別形成精胺、尸胺和腐胺，過多的生物胺類物質(zhì)積累會引起許多副作用，如嘔吐、惡心、發(fā)燒等癥狀[13]。此外，各生物胺之間還可以通過抑制某些生物胺相關(guān)代謝酶的活性，使生物胺數(shù)量增加，進而增強人體的不適癥狀。

氨基酸脫羧酶實驗結(jié)果見表4。6株副干酪乳桿菌的精氨酸、賴氨酸、鳥氨酸脫羧酶實驗均呈陰性，對照菌株大腸桿菌呈陽性，說明這6株菌不產(chǎn)生氨基酸脫羧酶，對人體無害。此結(jié)果與徐傳標等[25]的干酪乳桿菌的氨基酸脫羧酶實驗結(jié)果一致。

3 結(jié)論與討論

本研究通過藥敏試驗、質(zhì)粒提取實驗、溶血實驗、吲哚實驗和氨基酸脫羧酶實驗，從耐藥性檢測和有害代謝產(chǎn)物研究兩個方面對醬油渣中分離的6株副干酪乳桿菌體外安全性進行評價。

對菌株抗生素耐藥性的測定，是對現(xiàn)有的和潛在的益生菌菌株體外安全性評估的重要內(nèi)容之一。本研究采用紙片擴散法探究了6株副干酪乳桿菌對青霉素、頭孢噻吩、環(huán)丙沙星、紅霉素、慶大霉素、復(fù)方新諾明、氯霉素的敏感情況，結(jié)果表明，6株菌均對慶大霉素、復(fù)方新諾明表現(xiàn)為耐藥，HT31、HT90、HT155、HT159、HT197對青霉素、頭孢噻吩、紅霉素、氯霉素敏感，對環(huán)丙沙星中度耐藥，HT111對青霉素、頭孢噻吩、紅霉素、氯霉素、環(huán)丙沙星敏感，原因可能是副干酪乳桿菌對抑制細胞壁合成酶和蛋白質(zhì)合成的藥物較為敏感[15-16]?？股啬退幓蚩赏ㄟ^質(zhì)粒在食品和腸道環(huán)境中發(fā)生轉(zhuǎn)移，通過質(zhì)粒提取實驗探究6株副干酪乳桿菌是否有攜帶耐藥基因的質(zhì)粒存在，結(jié)果表明，6株菌均不存在攜帶耐藥基因的質(zhì)粒，與之前多篇文獻研究結(jié)果一致[19-20]。綜上，6株副干酪乳桿菌對2種抗生素表現(xiàn)為抗性(慶大霉素、復(fù)方新諾明)，其中HT31、HT90、HT155、HT159、HT197對4種抗生素敏感(青霉素、頭孢噻吩、紅霉素、氯霉素)，對1種抗生素中度耐藥(環(huán)丙沙星)，HT111對5種抗生素敏感(青霉素、頭孢噻吩、紅霉素、氯霉素、環(huán)丙沙星)，且均不攜帶耐藥質(zhì)粒。

菌株的安全性研究還需對其毒性代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生予以重視。本研究通過吲哚實驗、氨基酸脫羧酶實驗、溶血實驗探究了6株副干酪乳桿菌毒性代謝產(chǎn)物的生成情況，結(jié)果表明，6株副干酪乳桿菌均不產(chǎn)生色氨酸酶和氨基酸脫羧酶，不會產(chǎn)生吲哚、精胺、尸胺和腐胺等有害物質(zhì)，與之前副干酪乳桿菌相關(guān)有毒代謝產(chǎn)物研究的結(jié)果一致[20,25]，HT197出現(xiàn)β-溶血現(xiàn)象，此前也有研究發(fā)現(xiàn)從發(fā)酵食品中分離的乳酸菌會產(chǎn)生β-溶血[22]，產(chǎn)生這種溶血現(xiàn)象的菌株安全性較低，有引起敗血癥等疾病的風(fēng)險[5]，其他5株菌均未出現(xiàn)β-溶血現(xiàn)象。綜上，6株副干酪乳桿菌在耐藥性檢測、產(chǎn)有害代謝物吲哚、精胺、尸胺和腐胺方面相對安全，在溶血方面，HT197為β-溶血，而其余5株菌沒有出現(xiàn)β-溶血，因此認為這5株菌具有良好的安全性。

當(dāng)前，解決醬油渣資源浪費問題的研究主要集中在提取其中附加值較高的物質(zhì)或用作動物飼料方面，對醬油渣中微生物的開發(fā)利用尚不足。醬油渣是醬油發(fā)酵的副產(chǎn)物，微生物種類豐富，從中篩選出性能良好并安全的菌株用作發(fā)酵劑能很大程度改善醬油渣的品質(zhì)和安全性，從而減輕資源浪費問題。本研究對從醬油渣中分離得到的6株副干酪乳桿菌的體外安全性進行評價，最終得出HT31、HT90、HT111、HT155、HT159的安全性較高，為實際應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)。在后續(xù)實驗中將進一步通過毒力基因、動物實驗對其安全性進行探究，為其作為發(fā)酵劑用于醬油渣等發(fā)酵食品中的應(yīng)用安全性提供更加科學(xué)全面的理論依據(jù)。