茨河腐乳細菌與真菌多樣性及其功能關聯(lián)分析

腐乳(sufu)是一種傳統(tǒng)發(fā)酵食品，一般用于調(diào)味，以富含植物蛋白的豆腐為原材料，通過傳統(tǒng)的固態(tài)發(fā)酵工藝制成，因此腐乳發(fā)酵過程中的微生物對腐乳的風味品質影響極大[1]。按照色澤與風味，腐乳可被分為青方腐乳、紅方腐乳，白方腐乳、花色腐乳和醬腐乳等；同時按照發(fā)酵所用的微生物類型，又可以將腐乳分為毛霉型、根霉型和細菌型腐乳等[2]。

腐乳中含有豐富的植物蛋白質及被微生物降解產(chǎn)生的多肽和游離氨基酸，B族維生素，且不含膽固醇(或者膽固醇含量極低)，另外還含有對人體有益的亞油酸，油酸，鈣磷等無機鹽礦物質，且經(jīng)過微生物的發(fā)酵作用后，原有的抗營養(yǎng)成分被降解，呈豆腥味的分子被降解，變得易于消化[1]。據(jù)報道，腐乳還富含大豆異黃酮，大豆多肽，低聚肽，具有抗氧化、降血壓、降膽固醇、改善阿爾茲海默病，還具有抗疲勞作用，這些都與腐乳制作過程中的微生物作用密不可分[1-3]。

花色腐乳與紅方腐乳、白方腐乳的主要差異在于使用的輔料與工藝。研究表明，不同類型腐乳的菌群組成不同，白方腐乳和紅方腐乳的菌群較為接近。紅方腐乳中的主要微生物有乳球菌屬(Lactococcus spp.)，不動桿菌屬(Acinetobacter spp.)，四聯(lián)菌屬(Tetragenococcus spp.)；白方腐乳的主要微生物有不動桿菌屬，乳球菌屬，假單胞菌屬(Pseudomonas spp.)，四聯(lián)菌屬，乳桿菌屬(Lactobacillus spp.)，金黃桿菌屬(Chryseobacterium spp.)[4]。青方腐乳的主要微生物類群為乳桿菌屬、Chishuiella spp.、四鏈球菌屬。恩施地區(qū)的花色腐乳中的細菌主要為假單胞菌屬、不動桿菌屬、鞘氨醇桿菌屬(Sphingobacterium spp.)、布丘氏菌(Buttiauxella)和草螺菌(Herbaspirillum)。張雅婷等[5]報道了腐乳中的主要真菌有霉菌，包括毛霉屬(Mucor spp.)，根霉屬(Rhizopus spp.)等，以及酵母菌，包括裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces spp.)，假絲酵母屬(Candida spp.)，畢赤酵母屬(Pichia spp.)等。

風味是食品最重要的指標之一。盡管茨河花色腐乳風味較好，但該地區(qū)腐乳目前主要通過自然發(fā)酵法制作，無適用的微生物發(fā)酵劑，且發(fā)酵過程中腐乳菌群容易受到環(huán)境影響，造成產(chǎn)品質量不穩(wěn)定，同時目前對該地區(qū)的花色腐乳中的微生物研究較少。第二代高通量測序技術具有成本低、通量高、可以快速產(chǎn)生大量數(shù)據(jù)的優(yōu)點，能準確的分析發(fā)酵食品的微生物菌群組成。在食品檢測中廣泛應用的電子鼻與電子舌的分析結果不易受主觀因素影響。因此本研究首先采集茨河地區(qū)花色腐乳樣品，應用電子舌與電子鼻對腐乳的風味進行測定，繼而通過MiSeq測序技術分析腐乳的真菌與細菌微生物多樣性，并對腐乳的菌群與風味進行關聯(lián)分析，以期為腐乳中有價值的微生物菌種的分離與篩選及腐乳的工業(yè)生產(chǎn)提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

花色腐乳：采集自湖北省襄陽市谷城縣茨河鎮(zhèn)(111.85 °E, 32.04 °N)。首先將腐乳樣品裝入無菌瓶，然后裝入低溫樣品箱，迅速帶回微生物實驗室，使用液氮冷凍后放入-70 ℃冰箱備用。腐乳樣品要求無異味，色澤正常。腐乳樣品編號為CH1～CH10，不同編號樣品采集于不同商家或者農(nóng)戶。在使用MiSeq高通量測序技術對CH1腐乳細菌和真菌進行分析時，為便于區(qū)分同一樣品分別編號為BCH1和FCH1，其他樣品依次類推。

試劑：用于真菌ITS間區(qū)擴增的通用引物對ITS3F(5′-GCATCGATGAAGAACGCAGC-3′)和ITS4R(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)、用于細菌16S rRNA V3～V4區(qū)擴增的通用引物對338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)，由武漢天一輝遠有限公司合成；dNTPs Mix、PrimeSTAR HS DNA Polymerase、5×PrimeSTAR Buffer，寶生物工程大連有限公司；E.Z.N.A.?土壤DNA試劑盒，美國Omega Bio-tek公司。電子鼻測定用陽離子溶液、陰離子溶液、內(nèi)溶液和參比溶液，日本INSENT公司。

1.2 儀器與設備

Vetiri梯度基因擴增儀，美國ABI公司；WD-9413B型化學發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)、DYY-6C型電泳儀，北京六一生物科技有限公司；ND-2000C型微量紫外分光光度計，美國Nano Drop公司；PEN3電子鼻，德國Airsense公司；SA-402B型電子舌，日本Insent公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 腐乳樣品DNA提取，PCR擴增與高通量測序

腐乳樣品的DNA提取使用E.Z.N.A.?土壤DNA試劑盒，參照說明書進行。將提取到的DNA使用瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后，分別用于細菌和真菌的PCR擴增。對于真菌：參照鄧長陽等[6]的方法，使用真菌帶有barcode的通用引物ITS3F與ITS4R進行PCR擴增。PCR程序與體系均參照鄧長陽等[6]的方法進行。PCR產(chǎn)物使用瓊脂糖凝膠電泳與微量紫外分光度計檢測。對于細菌：參照GUO等[7]的方法，使用細菌16S rRNA的V3～V4擴增的通用引物338F和806R。將真菌和細菌的PCR產(chǎn)物送上海美吉生物醫(yī)藥科技公司基于Illumina MiSeq第2代測序平臺測序。

1.3.2 生物信息學分析

將MiSeq測序平臺產(chǎn)生的原始序列使用QIIME 1.9.2平臺進行生物信息學分析[8]，步驟如下：使用FLASH將雙末端序列基于重疊區(qū)域合并[9]，去掉低質量序列，去掉接頭；按照97%的相似度使用UCLUST[10]聚類產(chǎn)生分類操作單元(operational taxonomic unit，OTU)，使用UCHIME[11]去掉嵌合體。對于真菌，基于UNITE數(shù)據(jù)庫對OTU的代表性序列進行分類鑒定[12]；對于細菌，基于Ribosomal Database Project (RDP) v11.5，Greengene database v13.5以及SILVA database v132數(shù)據(jù)庫[13-15]進行聯(lián)合鑒定。最后使用QIIME平臺自帶程序分別計算腐乳樣品真菌和細菌的α與β多樣性。將相對含量>1%的分類單元定義為優(yōu)勢分類單元。

1.3.3 腐乳滋味與氣味測定

使用電子舌和電子鼻分別對腐乳滋味和氣味進行測定與分析，具體參照崔夢君等[16]的方法進行。

1.3.4 統(tǒng)計分析與作圖

使用R包vegan v2.5-7(https://cran.r-project.org/web/packages/vegan/index.html)進行去趨勢對應分析(detrended correspondence analysis, DCA)和冗余分析(redundancy analysis, RDA)；使用R自帶的corr.test函數(shù)進行Pearson相關性分析；對數(shù)據(jù)的描述性統(tǒng)計使用R包pastecs(https://cran.microsoft.com/snapshot/2019-06-14/web/packages/pastecs/index.html)完成；文中所有圖使用Origin 8.5軟件或者R包ggplot2完成。

2 結果與分析

2.1 腐乳微生物多樣性分析

通過高通量測序技術，分別以細菌16S rRNA基因的V3～V4區(qū)以及真菌的ITS區(qū)序列為靶點進行了MiSeq高通量測序與生物信息學分析。經(jīng)過序列質控，共得到367 262條高質量16S reads，使用Uclust聚類分析，共得到4 652個OTU。接下來通過數(shù)據(jù)庫Greengenes，RDP以及SILVA，將這些序列共注釋為7個細菌門，11個綱，19個目，36個科，以及67個屬(見表1)。

表1 茨河花色腐乳樣品的序列與微生物多樣性表
Table 1 Sequence abundance and microbial diversity of sufu samples from Cihe town

注：—表示無

2.2 腐乳菌群結構分析

對花色腐乳的優(yōu)勢細菌門進行了統(tǒng)計，結果見圖1。由圖1-a可知花色腐乳共有3個優(yōu)勢菌門，分別是變形菌門(Proteobacteria)[(55.38±9.29)%]，厚壁菌門(Firmicutes)[(35.47±8.35)%]，擬桿菌門(Bacteroidetes)[(7.25±2.68)%]，其中變形菌門占一半以上。對相對含量>1%的細菌屬進行統(tǒng)計分析見圖1-b，發(fā)現(xiàn)花色腐乳中優(yōu)勢細菌屬有6個：假單胞菌屬[(51.67±9.68)%]，乳桿菌屬[(25.38±7.51)%]，鞘氨醇桿菌屬[(6.88±2.56)%]，明串珠菌屬[(Leuconostoc spp.)(5.10±2.22)%]，腸球菌屬[(Enterococcus spp.)(1.15±0.69)%]，不動桿菌屬[(1.03±0.47)%]，其中假單胞菌占了50%以上，屬于絕對優(yōu)勢屬；另外對發(fā)酵食品比較重要的乳酸菌共占比31.63%。

盡管目前對花色腐乳中的微生物研究較少，然而已有不少研究對紅方腐乳，白方腐乳和青方腐乳中的微生物多樣性進行了解析。孫娜等[17]的研究表明，青方腐乳(臭豆腐)成品中的細菌以乳桿菌(23.44%)、Chishuiella(21.45%)、四鏈球菌屬(16.28%)為主。紅方腐乳成品中的優(yōu)勢菌屬為乳球菌屬、四聯(lián)球菌屬和不動桿菌屬[4]。在紅方腐乳和青方腐乳中均未出現(xiàn)占比超過50%的絕對優(yōu)勢屬，且假單胞菌的相對含量也未超過1%[18]。通過可培養(yǎng)方法，對毛霉型腐乳的研究顯示，優(yōu)勢菌屬為乳球菌屬、短桿菌屬(Brevibacterium spp.)、穩(wěn)桿菌屬(Empedobacter spp.)、四聯(lián)球菌屬、鞘氨醇桿菌屬，魏斯氏菌屬(Weissella spp.)、鹽厭氧菌屬(Halanaerobium)和金葡桿菌屬[19]。綜合這些結果，不難看出，花色腐乳中細菌類群與其他類型的腐乳菌群差異較大，這也可能是導致其風味差異的重要原因。而同省的恩施州利川花色腐乳中的優(yōu)勢屬與茨河花色腐乳較為接近，主要由假單胞菌屬、不動桿菌屬、鞘氨醇桿菌屬等菌屬構成[20]。另外也有研究表明，白方腐乳中也存在著假單胞菌，但是相對含量遠低于花色腐乳[4]。

對真菌測序得到的原始序列進行質控與系列的雙末端合并，共得到733 129個高質量序列，經(jīng)過OTU聚類，并進行分類鑒定后，得到6個真菌門，17個真菌綱，38個真菌目，73個真菌科及111個真菌屬。統(tǒng)計后發(fā)現(xiàn)，腐乳中真菌優(yōu)勢菌門有為子囊菌門(Ascomycota)[(39.52±16.02)%]，擔子菌門(Basidiomycota)[(35.69±18.88)%]和Mucoromycota[(24.66±19.75)%](圖2-a)；優(yōu)勢真菌屬為紅酵母屬[(25.76±16.76)%]，毛霉屬[(24.64±19.74)%]，青霉屬[(12.14±8.25)%]，間座殼屬[(7.65±5.49)%]，赤霉屬[(5.17±2.69)%]，Naganishia[(4.50±6.15)%]，節(jié)擔菌屬(Wallemia spp.)[(2.70±1.50)%]，棒孢菌屬(Clavispora spp.)[(2.57±2.59)%]，Guehomyces[(2.36±4.67)%]，交鏈孢霉屬(Alternaria spp.)[(2.23±1.53)%]，分枝孢子霉屬(Cladosporium spp.)[(1.88±1.13)%]，曲霉屬(Aspergillus spp.)[(1.54±1.12)%]和畢赤酵母屬[(1.25±0.81)%]，含5個酵母屬與8個霉菌屬。

a-優(yōu)勢菌門;b-優(yōu)勢菌屬
圖1 茨河花色腐乳樣品細菌優(yōu)勢菌門與優(yōu)勢菌屬(n=10)
Fig.1 Dominant bacterial phyla and genera of huase sufu samples Cihe town (n=10)

對紅方腐乳和另外一種毛霉型腐乳研究顯示，其主要真菌組成為曲霉屬(48.81%)和紅曲霉屬(Monascus spp., 37.18%)，而重慶地區(qū)的腐乳中優(yōu)勢菌屬為交鏈孢霉屬、赤霉菌屬，湖南白溪腐乳的優(yōu)勢真菌為地霉菌屬(Geotrichum spp.)和被孢霉屬(Mortierella spp.)[21-23]，盡管不同的腐乳樣品中優(yōu)勢菌群一般都是霉菌和酵母，但是在屬水平上差異很大，而紅酵母屬是花色腐乳中含量最大且具有特色的真菌類群。紅酵母屬是擔子菌門常見的酵母類群，可在土壤、海洋和湖水、果汁和牛奶中以及浴簾和牙刷上分離到，能分解蛋白質和脂肪產(chǎn)生氨基酸和小分子揮發(fā)性有機物[24]，因此可能對腐乳風味具有作用。

Pearson相關系數(shù)取值范圍為[-1,1]，可用來衡量兩個變量的關系，該值>0時，屬于正相關，<0時，為負相關。生境中的微生物存在著復雜的生態(tài)關系，基于相對豐度，對微生物進行了相關性分析(圖3)，發(fā)現(xiàn)鞘氨醇桿菌與紅酵母呈正相關(P<0.05)，同時與青霉菌呈負相關(P<0.01)；不動桿菌與Naganishia呈正相關(P<0.05)，腸球菌與節(jié)擔菌屬呈正相關(P<0.01)，而假單胞菌與畢赤酵母呈顯著負相關(P<0.05)。這表明，細菌中占比最高的假單胞菌和畢赤酵母可能存在相互抑制，而真菌中相對含量最高的菌屬紅酵母屬與鞘氨醇桿菌屬有相互促進的代謝作用。

a-優(yōu)勢菌門；b-優(yōu)勢菌屬
圖2 茨河花色腐乳樣品真菌優(yōu)勢菌門與優(yōu)勢菌屬(n=10)
Fig.2 Dominant fungi phyla and genera of huase sufu samples Cihe town (n=10)

圖3 茨河花色腐乳樣品中真菌與細菌屬相關性分析
Fig.3 Correlation analysis between fungi and bacteria in huase sufu samples from Cihe town 注：*，P<0.05;**, P<0.01;***, P<0.001(下同)

2.3 腐乳滋味與風味品質測定

滋味品質是食品的重要特征。使用電子舌對腐乳的滋味品質進行了測定與統(tǒng)計分析，結果見表2，10個腐乳樣品的酸味與咸味的差異最大，極差值均>5，且苦味，澀味，鮮味，后味A(澀味的回味)，后味B(苦味的回味)與豐厚度(鮮味的回味)的極差值也>1，表明這些腐乳樣品在滋味上的差異可以通過感官分辨出來。

表2 基于電子舌的花色腐乳樣品的各滋味 指標相對強度(n=10)
Table 2 Relative intensity of different taste indexes of sufu samples using electronic tongue (n=10)

同樣的，通過電子鼻對腐乳的氣味進行了測定與統(tǒng)計分析，電子鼻各傳感器對腐乳的響應值見圖4。結果表明，10個茨河花色腐乳的氣味各指標存在差異，其中W1S，W5S與W1W傳感器的響應值與極差值較大，極差值均超過了10，且W5S與W1W的響應值與極差值最大，極差值超過了70，表明采集的10個腐乳樣品的差異主要體現(xiàn)在氮氧化物，有機硫化物與萜類化合物，甲烷和乙醇。

圖4 基于電子鼻的茨河花色腐乳樣品氣味各傳感器 強度箱型圖(n=10) Table 4 Boxplot of relative intensity of taste indexes for sufu samples using electronic nose Cihe town (n=10) 注：W1C-對芳香味物質靈敏；W3C-芳香類物質靈敏；W5C-對烷烴； 芳香類物質靈敏；W1S-對甲烷靈敏；W2S-對乙醇靈敏；W3S-對烷烴靈敏； W5S-對氮氧化物靈敏；W6S-對氫氣靈敏；W1W-對有機硫化物； 萜類物質靈敏；W2W-對有機硫化物靈敏

2.4 菌群與腐乳品質關聯(lián)分析

對花色腐乳樣品優(yōu)勢屬相對含量與滋味、氣味指標數(shù)據(jù)進行DCA，其最大梯度長都<1，因此判斷腐乳樣品數(shù)據(jù)更適合用線性模型分析?；诰€性模型的RDA結果見圖5。

圖5 茨河花色腐乳樣品滋味與氣味品質與 菌群優(yōu)勢屬的RDA
Fig.5 RDA analysis of taste and smell and dominant genera of sufu samples from Cihe town

圖5顯示，軸1能解釋97.62%的茨河花色腐乳風味品質，而軸2能解釋1.25%的腐乳風味品質，總體上來看，茨河花色腐乳樣品的品質與腸球菌屬、紅酵母屬、鞘氨醇單胞菌屬、假單胞菌屬和不動桿菌屬關聯(lián)度最強：與腸球菌屬、紅酵母屬、鞘氨醇單胞菌屬呈負相關，而與假單胞菌屬、不動桿菌屬呈正相關。同樣的，也有研究顯示，腸球菌與腐乳的大部分香味物質呈負相關關系[18]。然而，由于RDA并不能判斷出來菌群具體與哪種滋味或者氣味品質的關聯(lián)，因此我們使用Pearson相關分析來進一步做了判定，結果見圖6?？傮w上來說，與茨河花色腐乳滋味顯著相關的微生物有青霉、毛霉、節(jié)擔菌、鞘氨醇單胞菌、腸球菌和紅酵母；與腐乳滋味相關的微生物有交鏈孢霉屬、赤霉屬、假單胞菌屬、明串珠菌、乳桿菌、腸球菌、紅酵母和Naganishia；同時與腐乳滋味與氣味相關的微生物有腸球菌、紅酵母和Naganishia。具體來說，紅酵母和腸球菌與腐乳咸味呈顯著負相關(P<0.05)；僅青霉與腐乳的后味A與后味B呈負相關(P<0.05)；對于豐厚度，有多種微生物(節(jié)擔菌屬、鞘氨醇單胞菌和腸球菌)均呈現(xiàn)出負相關關系(P<0.05)，與之相反，毛霉呈極顯著正相關(P<0.01)，因此推測毛霉與青霉對腐乳的滋味品質具有促進作用，而節(jié)擔菌等的代謝作用則可能產(chǎn)生不好的口感?？傮w來看，青霉與毛霉都對腐乳的滋味品質有促進作用，前者有助于去除澀味與苦味的回味，而毛霉能促進腐乳的豐厚度，但未發(fā)現(xiàn)與腐乳酸味，苦味，澀味，鮮味顯著相關的細菌或真菌。

圖6 茨河花色腐乳風味品質與菌群相關性分析
Fig.6 Correlation analysis between flavor quality and microbiol flora of huase sufu Cihe town

從氣味上來說，與腐乳的芳香味呈正相關的菌有交鏈孢霉屬和赤霉屬(P<0.05)；與腐乳有機硫化物傳感器信號強度呈正相關的有腸球菌，呈負相關的有赤霉菌和交鏈孢霉菌(P<0.05)；與對氮氧化物呈正相關的菌有腸球菌，呈負相關的有交鏈孢霉屬和赤霉屬(P<0.05)；與腐乳氫氣呈正相關的有明串珠菌和乳桿菌，呈負相關的為假單胞菌(P<0.05)；與腐乳乙醇呈負相關的為赤霉菌和交鏈孢菌(P<0.05)；與甲烷呈負相關的為赤霉菌和交鏈孢菌，呈正相關的為紅酵母(P<0.05)。由于氮氧化物，有機硫化物，芳香味和乙醇等信號強度與腐乳的特征指標，因此交鏈孢霉菌、赤霉菌以及腸球菌對茨河花色腐乳具有重要的影響，可以后續(xù)從腐乳中篩選這些真菌，以明確這些菌的具體功能，以期在腐乳生產(chǎn)中應用。

3 結論

茨河花色腐乳中的優(yōu)勢真菌有紅酵母屬、毛霉屬、青霉屬、間座殼霉屬、赤霉屬、Naganishia、節(jié)擔菌屬、棒孢菌屬、Guehomyces、交鏈孢霉屬、分枝孢子霉屬、曲霉屬和畢赤酵母屬，其中紅酵母，毛霉和青霉相對含量均超過了10%；優(yōu)勢細菌屬有假單胞菌屬、乳桿菌屬、鞘氨醇桿菌屬、明串珠菌屬、腸球菌屬和不動桿菌屬，其中假單胞菌屬作為絕對優(yōu)勢屬，其相對含量超過了50%以上。茨河花色腐乳滋味差異體現(xiàn)在咸味和酸味上，而氣味差異主要在于氮氧化合物，有機硫化物或/和萜類化合物上。相關性分析表明，交鏈孢霉屬和赤霉屬與腐乳的芳香味呈顯著正相關，而青霉和毛霉可能有助于改善腐乳的滋味。本研究能為腐乳的生產(chǎn)及發(fā)酵用菌的篩選提供數(shù)據(jù)支持。