黃連對腸道致病菌的體外抑菌作用

黃連，最早記載于《神農本草經》，為毛莨科植物黃連(Coptis chinensis Franch.，味連)、三角葉黃連(Coptis deltoidea C.Y.Cheng et Hisao，雅連)、云連(Coptis teeta Wall.)的干燥根莖[1-2]。黃連抗菌譜廣，對各種細菌、真菌以及流感病毒均有一定的抑制作用，臨床常用其進行抗菌與抗病毒[3]。雅連對生長環(huán)境要求苛刻，且藥效最佳，歷代都被視為黃連屬的上品[4]。但由于雅連多為野生，生長慢且栽培采挖條件苛刻，目前產量較低，缺乏相關科學研究。

目前食源性疾病頻發(fā)[5]，多由于各種致病菌和腐敗菌的污染[6]，營養(yǎng)豐富的食物使得細菌更好的生長和繁殖并產生致病毒素[7]。因此為預防食源性疾病和延緩食品的腐敗變質，常在食品中加入防腐保鮮劑[8]。近年來，天然食品防腐保鮮劑的研究成為熱點，使用黃連等抗菌譜廣、高效且持久、無毒、無殘留與污染的天然植物或中草藥開發(fā)天然防腐劑受到越來越多的關注[9-10]。

黃連在抑菌抗菌方面具有顯著的藥理活性，但不同品種、不同炮制方式的黃連對常見腸道致病菌的抑菌作用研究未見報道，黃連抑菌作用的藥效物質基礎研究仍然不足。本實驗采用體外抑菌活性測定方法，分析比較不同品種及炮制方式的黃連對食品中常見的腸道致病菌的抑菌效果，為進一步明確黃連發(fā)揮抑菌作用的極性部位及藥效物質基礎提高參考，也為以黃連為原料開發(fā)天然抑菌劑提供思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料

味連(生品、酒制)，太極大藥房溫江店；雅連(生品、酒制)，四川洪雅縣瓦屋山藥業(yè)有限公司。

1.1.2 菌株

金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大腸埃希氏桿菌(Escherichia coli)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、陰溝腸桿菌(Enterobacter cloacae)、產氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes)、普通變形桿菌(Proteus vulgaris)、鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium.)、小腸結腸炎耶爾森氏菌(Yersinia enterocolitica)、福氏志賀氏菌(Shigella flexneri)，成都中醫(yī)藥大學醫(yī)學技術學院。

1.1.3 試劑與儀器

營養(yǎng)瓊脂，北京奧博星生物技術有限公司；氫氧化鈉、無水乙醇、甲醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、二甲亞砜，成都科隆化學品有限公司；PBS緩沖液，Life Technologies Corporation。

KH3200V超聲波清洗器，昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；RE-52A旋轉蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；YM-75高壓蒸汽滅菌，上海三申醫(yī)療器械有限公司；SPX-400-Ⅱ生化培養(yǎng)箱，上海躍進醫(yī)療器械有限公司；SW-CJ-2F超凈工作臺，蘇州安泰空氣技術有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 味連、雅連及其炮制品不同極性部位的制備

將烘干的黃連藥材干燥根莖粉碎，過20目篩，稱取100 g粉末，用70%甲醇水溶液超聲輔助提取3次，每次1 000 mL，合并提取液，減壓濃縮得粗提物浸膏。加水分散均勻，依次用等體積的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取3～4次，合并后減壓濃縮得甲醇提取物(methanol extracts，ME)、石油醚部位(petroleum ether extract，PE)、乙酸乙酯部位(ethyl acetate extract，EAE)、正丁醇部位(n-butanol extract，BE)和水部位(water extract，WE)浸膏，密封保存于4 ℃冰箱[11]。

1.2.2 抗菌初篩供試藥液的制備

將制備所得黃連各部位浸膏，用適量二甲亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)溶解并混合均勻，制成200 mg/mL的各藥材不同極性部位的供試藥液。

1.2.3 菌懸液的制備

在無菌操作條件下，將活化后的細菌接種到裝有5 mL PBS緩沖液的試管中，制成濃度約為1×108～2×108 CFU/mL的菌懸液。

1.2.4 抑菌活性測定

在無菌環(huán)境中，將濾紙片(直徑6 mm)分別浸泡于味連、雅連提取液及不同極性部位的藥液中浸泡4 h，取200 μL濃度約1×108CFU/mL的菌懸液均勻涂布在冷卻凝固的固體培養(yǎng)基上，將供試藥液濾紙片和空白濾紙片(DMSO溶液浸泡)呈等邊三角形貼在培養(yǎng)基上，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后測量抑菌圈大小。

1.2.5 最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)的測定

將味連、雅連及炮制品的甲醇粗提物用兩倍稀釋法制成質量濃度梯度為200、100、50、25、12.5、6.25 mg/mL的供試藥液。在96孔細胞培養(yǎng)板各孔中加入細菌菌懸液100 μL，于37 ℃條件下過夜培養(yǎng)后棄去孔內液體，用無菌PBS緩沖液漂洗1次。再向各孔中加入50 μL的不同濃度供試藥液和100 μL的液體培養(yǎng)基，在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中搖床培養(yǎng)24 h，肉眼觀察每個孔中是否產生渾濁，未見培養(yǎng)液渾濁的最低藥物濃度即為MIC。每個梯度的供試藥液重復3次，并設陰性對照組(50 μL空白溶劑)[12-13]。

2 結果與分析

2.1 抑菌效果初篩

由表1和圖1可知，4種藥材的提取物原液對9種腸道致病細菌都有一定的抑菌作用，對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑最大，且具有顯著差異(P<0.05)。4種藥材對福氏志賀氏菌、小腸結腸炎耶爾森氏菌、陰溝腸桿菌也表現(xiàn)出較強的抑菌作用(P<0.05)。

表1 藥材提取液原液對不同細菌的抑菌效果
Table 1 Antibacterial effects of extracts of different medicinal materials on different bacteria

注：n=3±s；表中同列數(shù)據(jù)后的小寫英文字母用以表示數(shù)據(jù)經最小顯著性差異法(least significant difference，LSD)法相互檢驗后差異是否呈顯著，其中若首字母不同表示向下比較差異顯著(P<0.05),首字母相同表示向下比較差異不顯著(P>0.05)，首字母后其他字母相同表示向上比較差異不顯著(P>0.05)(下同)

圖1 四種藥材對9種腸道致病菌的抑菌效果
Fig.1 Antibacterial effect of 4 medicinal materials on 9 kinds of intestinal pathogenic bacteria

2.2 甲醇提取物及各極性段萃取物的抑菌作用

由表2和圖2可知，4種藥材對金黃色葡萄球菌抑菌效果表現(xiàn)出一致的趨勢，即ME>BE>WE>PE>EAE，表明除ME外，對金黃色葡萄球菌起抑菌效果的成分主要存在于BE和WE部位。味連與雅連相比，無論是生品還是炮制品，均表現(xiàn)出對金黃色葡萄球菌更強的抑菌性(P<0.05)。4種藥材的ME部位、味連BE、WE部位對福氏志賀氏菌的抑菌效果最好(P<0.05)，4種藥材的ME部位對福氏志賀氏菌的抑菌效果無顯著差異(P>0.05)，而各極性部位有顯著差異(P<0.05)。對陰溝腸桿菌的抑菌效果最強的為生雅連和酒雅連的ME和WE部位，且顯著高于生味連和酒味連(P<0.05)，說明雅連對陰溝腸桿菌有更好的抑菌效果。生、酒味連及酒雅連的ME部位對小腸結腸炎耶爾森氏菌的抑菌效果最好，且酒雅連ME的抑菌效果強于生雅連ME(P<0.05)，說明雅連經酒制后，對小腸結腸炎耶爾森氏菌的抑菌效果有明顯增強。酒味連ME和BE部位、酒雅連ME部位對肺炎克雷伯有最好的抑菌效果，且顯著強于生品(P<0.05)，說明酒制之后的黃連對肺炎克雷伯菌有更好的抑菌效果。

通過比較味連和雅連ME部位的抑菌活性可得，味連對金黃色葡萄球菌、小腸結腸炎耶爾森氏菌的抑菌性強于雅連(P<0.05)，對福氏志賀氏菌、肺炎克雷伯抑菌活性兩者差異不顯著(P>0.05)，而對陰溝腸桿菌的抑菌性顯著弱于雅連，說明黃連的品種不同，對某些特定的細菌的抑菌效果亦有不同。

經過酒制后，雅連和味連對肺炎克雷伯氏菌抑菌活性均明顯增強，而對陰溝腸桿菌的抑菌活性減弱，說明炮制會影響黃連對某些細菌的抑菌效果。

4種藥材的抑菌活性最強部位為ME部位，除ME外，黃連抑菌效果最強的部位主要存在于BE部位和WE部位。

表2 黃連不同炮制不同極性部位對腸道致病菌的抑菌效果
Table 2 Antibacterial effects of different polar parts of Coptis herbs on intestinal pathogenic bacterias

注：*表示對不同腸道致病菌抑菌活性最佳的各極性部位(P<0.05)

2.3 最小抑菌濃度值的測定

由表3可知，4種黃連對腸道致病菌均有一定的抑菌活性，其中生味連對金黃色葡萄球菌的抑菌活性最強，其MIC值可達3.125 mg/mL。黃連對福氏志賀氏菌的MIC值在6.25～12.5 mg/mL左右，而對其他細菌MIC值為12.5～25 mg/mL。

a-生味連；b-酒味連；c-生雅連；d-酒雅連
圖2 各黃連的不同極性部位對5種腸道致病菌的抑菌效果
Fig.2 Antibacterial effects of polar parts of different Coptis herbs on 5 kinds of intestinal pathogenic bacterias

表3 黃連提取液原液對腸道致病菌的最小抑菌濃度 單位：mg/mL

Table 3 MIC of extracts of Coptis herbs against intestinal pathogenic bacterias

3 結論與討論

本實驗分析比較了味連及雅連對食品中常見9種腸道致病菌的抑菌活性，結果顯示，黃連表現(xiàn)出廣譜抑菌活性，對供試菌株均有不同程度的抑菌活性，其中對金黃色葡萄球菌的抑菌活性最強。

研究發(fā)現(xiàn)黃連的品種、炮制前后都會對抑菌活性產生影響：味連對金黃色葡萄球菌、小腸結腸炎耶爾森氏菌的抑菌效果更佳，而雅連對陰溝腸桿菌抑菌作用更強。經過酒制后，雅連和味連對肺炎克雷伯氏菌抑菌活性均明顯增強，原因可能是經過酒制，能提高多種生物堿等其他抑菌物質的溶出率[14-15]，從而影響抑菌效果，但進一步的抑菌機理和機制還有待深入探究。

4種中藥飲片的抑菌活性最強的部位為ME部位，說明黃連的抑菌效果是多種抑菌物質協(xié)同作用的結果。除ME外，黃連抑菌效果最強的部位為BE和WE部位，即正丁醇部位和水部位，推測其主要的抑菌成分是與極性較大的生物堿或者酸性成分有關[16]。

實驗通過比較黃連品種、炮制等因素對腸道致病菌的抑菌作用影響，但是選取的菌種、黃連的種類及炮制品的種類有限。在下一步的研究中，可進一步全面比較黃連品種和不同炮制品之間的抑菌活性差異，為后期對黃連抑菌成分的單體化合物的靶向分離及鑒定奠定基礎[17-20]，以發(fā)現(xiàn)新的具有較強抑菌活性的天然單體化合物，進一步闡釋黃連的抑菌機理，并對不同黃連品種的開發(fā)利用提供參考。