結冷膠裂解酶在畢赤酵母中的異源表達及其性質和應用

結冷膠是少動鞘氨醇單胞菌所產的多糖，其分子骨架由β(1→3)-D-葡萄糖、β(1→4)-D-葡萄糖醛酸、β(1→4)-D-葡萄糖和α(1→4)-L-鼠李糖線性四糖重復單元按摩爾比1∶1∶1∶1聚合組成，分子質量達0.5×106～1×106 Da[1-3]。結冷膠寡糖可由結冷膠降解得到，具有益生活性[4]、植物誘導抗病性[5]、提高免疫活性[6]等生物學功能，其制備具有重要意義。寡糖一般通過物理、化學、生物(酶)法降解多糖制備，比較3類方法，酶法特異性強，產物均一，是較理想的方法[7]。目前，缺乏有效降解結冷膠的酶是結冷膠及其寡糖應用的最大障礙。

結冷膠裂解酶(EC 4.2.2.25,gellan lyase)特異性裂解結冷膠主鏈的糖苷鍵，釋放非還原端為不飽和葡萄糖醛酸的葡萄糖醛基-葡萄糖基-鼠李糖基-葡萄糖四糖單元[8]。MIYAKE等[9]對來自Bacillus sp.GL1的結冷膠裂解酶在大腸桿菌中胞內表達，并對其應用進行了研究。通過基因工程技術獲得重組的功能蛋白，是進行工業(yè)用高效蛋白生產的重要途徑[10]。除大腸桿菌，目前研究比較深入的重組蛋白表達系統(tǒng)還有枯草芽胞桿菌和畢赤酵母(Pichia pastoris)等[11]。較其他表達系統(tǒng)，畢赤酵母表達宿主遺傳性能穩(wěn)定、表達外源蛋白分泌效率高、產物便于分離純化、誘導型菌株具有較完善的發(fā)酵策略，應用廣泛[12]。在畢赤酵母表達系統(tǒng)中，醇氧化酶AOX1基因強啟動子最為常用，受甲醇嚴格調節(jié)，誘導表達外源蛋白，能達到很高的生產水平[13]。

本研究首次應用畢赤酵母構建表達Bacillus sp.GL1來源結冷膠裂解酶基因，誘使結冷膠裂解酶胞外分泌，發(fā)酵擴大生產。經分離純化，重組結冷膠裂解酶的酶學性質被測定，并利用其對結冷膠進行降解，這是對獲得大量結冷膠裂解酶用于寡糖制備和工業(yè)應用的初步探索，為進一步開發(fā)利用結冷膠資源，擴大其應用范圍提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌株與質粒

大腸桿菌JM109、畢赤酵母GS115及分泌型酵母表達載體pPIC9K均購自美國Invitrogen公司，并保藏于糖化學與生物技術教育部重點實驗室。

1.1.2 試劑與儀器

限制性核酸內切酶(EcoR Ⅰ、Not Ⅰ和Sal Ⅰ)、DL-10 000 DNA Marker、SanPrep柱式質粒小量抽提試劑盒和Ezup柱式酵母基因組DNA抽提試劑盒等，大連TaKaRa公司；酵母粉、蛋白胨、甘油和無水甲醇等，國藥集團化學試劑有限公司；結冷膠(食品級)，無錫格萊克斯生物科技有限公司。

Micro Pulser型電轉儀、C1000 Touch型PCR儀，美國Bio-Rad公司；3K15型高速冷凍離心機，德國Sigma公司；Bio Flo 115型7 L發(fā)酵罐，美國NBS公司；ultrafleXtreme型質譜儀，美國Bruker Daltonics公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 10，pH 7.0(固體培養(yǎng)基加入瓊脂粉20 g/L)。

YPD培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨20，酵母粉10，葡萄糖 20(固體培養(yǎng)基加入瓊脂粉20 g/L)。

MD培養(yǎng)基(g/L)：無氨基酵母氮源(yeast nitrogen base, YNB)13.4，生物素4×10-5，葡萄糖20，瓊脂20。

MM培養(yǎng)基：YNB 13.4 g/L，生物素40 μg/L，甲醇5 mL/L，瓊脂20 g/L。

BMGY培養(yǎng)基：酵母粉10 g/L，蛋白胨20 g/L，磷酸鉀緩沖液100 mmol/L、pH 6.0，YNB 13.4 g/L，生物素40 μg/L，甘油10 g/L。

BMMY培養(yǎng)基：酵母粉10 g/L，蛋白胨20 g/L，磷酸鉀緩沖液100 mmol/L、pH 6.0，YNB 13.4 g/L，生物素 40 μg/L，甲醇 10 mL/L。

上述培養(yǎng)基在121 ℃滅菌20 min或115 ℃滅菌30 min。

1.2 實驗方法

1.2.1 重組表達質粒的構建及鑒定

選取Bacillus sp.GL1來源結冷膠裂解酶基因(GenBank ID:AB006853.1)中已報道的功能活性區(qū)域(N-terminal gellan lyase, nGL)[9]，根據畢赤酵母(P.pastoris GS115)的偏好性進行密碼子優(yōu)化后委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成結冷膠裂解酶基因(nGL1)，獲得商品重組克隆質粒pUC57-nGL1。根據優(yōu)化后的基因序列設計引物，分別在引物5′和3′端分別加上EcoR Ⅰ和Not Ⅰ酶切位點及保護堿基。本研究中PCR擴增體系所用引物如表1所示。

表1 本研究所用引物
Table 1 Primers used in this study

注：下劃線部分為酶切位點，小寫部分為保護堿基

pUC57-nGL1溶解稀釋至一定濃度用EcoRⅠ、NotⅠ雙酶切，經瓊脂糖凝膠電泳鑒定、回收、純化后，進而用T4 DNA連接酶連接到經過相同的工具酶線性化載體pPIC9K上，構建重組表達質粒pPIC9K-nGL1(圖1)，并轉化到E.coli JM109感受態(tài)細胞中富集。選取含有氨芐抗性LB平板上陽性克隆子，提取質粒使用EcoR Ⅰ和Not Ⅰ進行單酶切和雙酶切及菌落PCR鑒定。

圖1 重組表達質粒構建
Fig.1 Construction of recombinant expression plasmid

1.2.2 重組畢赤酵母的構建及驗證

鑒定成功的pPIC9K-nGL1經SalⅠ酶切線性化后電轉化入P.pastoris GS115染色體DNA中，30 ℃培養(yǎng)2～3 d，以得到轉化子。采用MD/MM平板點植對照法篩選甲醇快速利用型(Mut+)表型，進一步通過YPD-遺傳霉素(G418)平板篩選優(yōu)良的表達菌株[14]。隨機挑取其單菌落，接種于3 mL YPD液體培養(yǎng)基中，30 ℃、200 r/min過夜培養(yǎng)。以Ezup柱式酵母基因組DNA抽提試劑盒提取酵母基因組DNA為模板，進行PCR擴增，然后1.0%瓊脂糖凝膠檢測PCR結果。PCR鑒定正確的重組菌經測序驗證目的基因整合到酵母基因組中，將測序正確的菌株命名為P.pastoris GS115-pPIC9K-nGL1并于-40 ℃甘油管中保藏。

1.2.3 重組結冷膠裂解酶活性的測定

取適量酶液與Tris-HCl緩沖液(50 mmol/L，pH 7.0)混勻，加入終質量濃度為0.5 g/L的底物結冷膠溶液激活反應，渦旋振蕩1 min，于45 ℃水浴反應20 min后，煮沸10 min滅活。酶活力定義為在1 mL上述反應體系條件下，1 min轉化底物生成1 μmol還原糖所需的酶量為一個單位U。二硝基水楊酸(3,5-dinitrosalicylic acid，DNS)法測定反應體系中還原糖濃度[15]。

1.2.4 重組結冷膠裂解酶的誘導表達與篩選

參考Invitrogen公司的畢赤酵母表達系統(tǒng)操作手冊[16]，挑取構建成功的重組畢赤酵母單菌落接種至50 mL BMGY培養(yǎng)基中，30 ℃、200 r/min培養(yǎng)至OD600=2.0～6.0，4 ℃、4 000×g離心5 min收集菌體。用100 mL BMMY培養(yǎng)基重懸并稀釋至OD600=1.0，進行誘導培養(yǎng)；每隔24 h加入無水甲醇至終體積分數為0.5%，發(fā)酵120 h。發(fā)酵結束菌液4 ℃、8 000×g離心5 min收集上清液測定酶活力，并用8% SDS-PAGE檢測蛋白質表達情況。

1.2.5 重組結冷膠裂解酶的分離純化

發(fā)酵液上清液于80%飽和硫酸銨鹽析沉降，沉淀物復溶后4 ℃透析過夜，而后經葡聚糖凝膠Sephadex-G100柱層析[17]。層析組分加到預先經Tris-HCl緩沖液(0.1 mol/L, pH 7.0)平衡的DEAE-52纖維素層析柱，用0～0.8 mol/L NaCl溶液(同種緩沖液配制)進行線性梯度洗脫，設置280 nm測紫外吸光值，分管收集[18]得到純酶液，待處理樣品進行SDS-PAGE分析。

1.2.6 重組結冷膠裂解酶的酶學性質研究

最適反應溫度測定。分別在20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70 ℃條件下檢測結冷膠裂解酶酶活性，設最高酶活力為100%，計算各水平條件下相對酶活力。

溫度穩(wěn)定性檢測。取等量純酶液置于45、50、55 ℃水浴鍋中溫育，每隔30 min取樣，于冰上冷卻5 min，保持其他反應條件不變，計算相對酶活力。

最適反應pH測定。保持其他反應條件不變，反應體系中加入相同體積的pH值為4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、9.0、9.5的Tris-HCl緩沖液，設最高酶活力為100%，計算相對酶活力。

pH穩(wěn)定性檢測。取等量純酶液用相同體積的pH值為4、5、6、7、8、9、10、11的緩沖溶液懸浮，于4 ℃放置12 h，保持其他反應條件不變，隨后計算相對酶活力。

金屬離子穩(wěn)定性檢測。在酶反應體系中分別加入0.1 mol/L K+、Na+、Ca2+、Mg2+、Al3+、Zn2+、Fe3+、Mn2+，以不加金屬離子Tris-HCl緩沖液的酶的活性為100%，計算相對酶活力。

1.2.7 重組畢赤酵母工程菌的7 L發(fā)酵罐高密度培養(yǎng)

接種重組畢赤酵母單菌落于BMGY培養(yǎng)基，30 ℃、200 r/min培養(yǎng)24 h即得種子液。將2.7 L BMGY培養(yǎng)基加入7 L發(fā)酵罐內，經滅菌處理后調節(jié)發(fā)酵體系維持在30 ℃、pH 6.0并穩(wěn)定2 h。隨后加入300 mL種子液。對發(fā)酵罐的通氣量和轉速進行調節(jié)，維持溶氧在20%上下，培養(yǎng)20～24 h，使得發(fā)酵液中的所有甘油被消耗完。此時進入展開甲醇誘導培養(yǎng)階段，調pH 6.0，并處于30 ℃條件下。利用同時反饋控制辦法進行在線測定[19]，甲醇質量濃度維持在10 g/L。發(fā)酵過程中，每間隔6 h需要對典型生化指標進行測定和記錄，如生物量和結冷膠裂解酶活力。

1.2.8 重組結冷膠裂解酶的裂解產物分析

以低質量濃度0.5 g/L的結冷膠溶液為底物進行酶促降解反應，每隔30 min取樣，用展開劑(正丙醇∶乙酸∶水=5∶2∶3，體積比)于Merck薄層板(TLC Silica gel 60F 254, 20×20 cm)上將產物分離進行薄層色譜法(thin-layer chromatography，TLC)分析。為進一步鑒定降解產物，反應結束后樣品經0.22 μm水系膜過濾器過濾后以2,5-二羥基苯甲酸(2,5-dihydroxybenzoic acid，DHB)為基質，利用基質輔助激光解析電離飛行時間質譜(matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry, MALDI-TOF-MS)在正離子模式下對產物寡糖的質荷比進行分析，以確定結冷膠寡糖的聚合度[20]。

1.3 數據處理

實驗設置3次平行，測定參數取平均值，利用Origin 8.5軟件繪制圖表并進行數據處理分析。

2 結果與分析

2.1 重組畢赤酵母的構建及篩選

陽性克隆子經菌落PCR驗證提取重組質粒并分別使用EcoR Ⅰ和Not Ⅰ進行單酶切和雙酶切驗證。結果如圖2-a，在瓊脂糖凝膠上EcoR Ⅰ或Not Ⅰ單酶切的產物大小約12 827 bp的單條帶，EcoRⅠ和NotⅠ雙酶切分別得到3 551 bp的nGL1片段和9 276 bp的線性pPIC9K片段，表明重組表達質粒pPIC9K-nGL1構建成功。

經電轉、篩選，隨機選擇8株陽性轉化子于YPD液體培養(yǎng)基中擴培，然后取適量菌液PCR驗證，結果如圖2-b，在瓊脂糖凝膠3 551 bp的位置上有明顯條帶即nGL1片段，表明重組質粒pPIC9K-nGL1已成功電轉化入畢赤酵母GS115細胞中，經進一步測序表示基因工程菌重組P.pastoris GS115-pPIC9K-nGL1構建成功。

a-重組表達質粒電泳鑒定圖(M-Marker；1-NotⅠ單切； 2-EcoRⅠ單切；3-NotⅠ和EcoRⅠ雙切；4-菌落PCR)； b-重組畢赤酵母電泳驗證圖(M-Marker； 1～8-陽性轉化子PCR結果；9-空質菌PCR結果)
圖2 重組畢赤酵母的構建及驗證篩選
Fig.2 Construction and validation of recombinant P.pastoris

2.2 重組結冷膠裂解酶的誘導表達及鑒定

利用ExPASy預測本研究中結冷膠裂解酶分子質量約為125 kDa。重組畢赤酵母搖瓶誘導表達并測定酶活力，如圖3-a，篩選得到高酶活力菌株P.pastoris GS115-pPIC9K-nGL1.2酶活力為266.4 U/L。

a-重組結冷膠裂解酶高酶活菌株篩選 (1～8-陽性轉化子；9-空質菌)； b-重組結冷膠裂解酶SDS-PAGE電泳分析(1-空質菌上清液； 2、3-重組菌上清；4、5-初步純化后酶液)
圖3 重組結冷膠裂解酶的誘導表達及鑒定
Fig.3 Induced expression and identification of recombinant gellan lyase

用相同方法培養(yǎng)處理空質菌P.pastoris GS115-pPIC9K作為空白對照。分別取適量粗酶液處理進行SDS-PAGE分析，結果如圖3-b，P.pastoris GS115-pPIC9K-nGL1.2上清液與空質菌對照相比在分子質量75和45 kDa處均有明顯的蛋白表達帶。進一步分離純化重組結冷膠裂解酶，經過SDS-PAGE電泳檢測，所得純化酶液位置與粗酶液加粗條帶一致，大小正確。但所收集組分未分離開，表現為電泳條帶無單條存在，分析可能是結冷膠裂解酶發(fā)生降解。

2.3 重組畢赤酵母工程菌的7 L發(fā)酵罐高密度培養(yǎng)

對高酶活力菌株P.pastoris GS115-pPIC9K-nGL1.2進行7 L發(fā)酵罐高密度培養(yǎng)，結果如圖4所示，隨著發(fā)酵的進行，重組畢赤酵母生物量最高達78.5 g/L，結冷膠裂解酶酶活力達954.6 U/L，相比于搖瓶表達最高酶活力(266.4 U/L)提高了3.58倍。

圖4 重組畢赤酵母7 L發(fā)酵罐發(fā)酵
Fig.4 Recombinant P.pastoris fermentation in 7 L bioreactor

2.4 結冷膠裂解酶的酶學性質研究

2.4.1 重組結冷膠裂解酶反應的最適溫度及溫度穩(wěn)定性

溫度影響酶的空間結構。在一定溫度范圍內，溫度升高，酶反應速率提高；高溫或低溫都會降低酶的催化效率，溫度過高甚至引起不可逆的蛋白變性[21]。研究結果見圖5-a，在30～50 ℃時，重組結冷膠裂解酶相對酶活力超過80%。其中，相對酶活力在45 ℃時最高，這與原始菌裂解酶性質一致[9]。該重組酶溫度穩(wěn)定性結果如圖5-b，總體而言，酶活力的降低同保溫時間呈正相關關系；45 ℃下酶活力降低速度相對較緩，即使放置10 h相對酶活力依然大于80%。重組酶對反應溫度和保藏溫度要求較高，選擇合適的條件是提高寡糖產量的基礎。

2.4.2 重組結冷膠裂解酶反應的最適pH及pH穩(wěn)定性

pH的改變影響酶分子中具有催化活性的離子基團解離程度，從而影響酶的催化能力[22]。由圖5-c可知結冷膠裂解酶最適pH 7.5，當pH值低于7.5時，酶活力迅速下降，當pH值降低到5.0時相對酶活力幾近為0。重組酶在弱堿性條件下容易發(fā)揮較大活性，考察重組結冷膠裂解酶的pH穩(wěn)定性，反應結果如圖5-d所示。從圖中明顯看出結冷膠裂解酶具有較大的耐堿范圍，這與其最適反應pH結果一致。當pH值處于7.0～9.0時，呈現出較為穩(wěn)定的狀態(tài)，剩余酶活力高于80%，相比于原始菌穩(wěn)定性得到了一定提升[9]。可能原因是畢赤酵母的糖基化功能，提高了重組酶的溫度穩(wěn)定性[10]。結果表明弱堿環(huán)境適合結冷膠裂解酶降解結冷膠。

a-最適溫度；b-溫度穩(wěn)定性；c-最適pH；d-pH穩(wěn)定性；e-金屬離子穩(wěn)定性
圖5 重組結冷膠裂解酶酶學性質
Fig.5 Enzymatic properties of recombinant gellan lyase

2.4.3 重組結冷膠裂解酶反應的金屬離子穩(wěn)定性

金屬離子通過與氨基酸殘基結合，影響酶活力[22]。以不含金屬離子的Tris-HCl緩沖液反應體系作為對照，考察不同金屬離子(K+、Ca2+、Na+、Mg2+、Al3+、Zn2+、Fe3+、Mn2+)對重組結冷膠裂解酶酶促反應的影響。結果如圖5-e，K+、Na+對重組酶酶活力既沒有促進作用，也沒有明顯的抑制作用，影響并不大；Zn2+對重組酶有微弱的促進作用，酶活力為對照組的108.9%；Ca2+、Mg2+、Al3+、Fe3+和Mn2+對重組酶則有著不同程度的抑制作用，其中Al3+抑制作用最強，相對酶活力僅44%。

a-結冷膠寡糖TLC分析圖(1-葡萄糖標品；2-蔗糖標品； 3-β-環(huán)糊精標品；4～10-30、60、90、120、150、180、0 min 結冷膠寡糖樣品；11-陰性對照組)；b-結冷膠寡糖 MALDI-TOF-MS分析圖
圖6 結冷膠裂解酶降解產物分析
Fig.6 Degree of polymerization of gellan oligosaccharide

2.5 結冷膠裂解酶降解產物分析

應用TLC聯用MALDI-TOF-MS分析結冷膠裂解酶降解產物。從圖6-a中可以看出，結冷膠裂解酶降解結冷膠的產物主要為一種，且隨著時間的延長，產物的種類沒有明顯的增加。如圖6-b，從降解產物的MALDI-TOF-MS分析結果來看，樣品被有效地離子化，得到陽離子化準分子離子(quasi-molecular ion)峰 [M+Na]+m/z=709.84，與結冷膠的明顯特征單元殘基吻合，判斷結冷膠的降解產物聚合度大致為4。說明重組結冷膠裂解酶可以有效降解結冷膠，具有特異性。根據結冷膠分子結構可初步確定該結冷膠寡糖是非還原端為不飽和葡萄糖醛酸的葡萄糖醛基-葡萄糖基-鼠李糖基-葡萄糖四糖單元，這與文獻報道相符[8]。因此，利用畢赤酵母異源表達的結冷膠裂解酶可以有效制備聚合度為4的結冷膠寡糖。

3 結論

首次成功將經優(yōu)化的Bacillus sp.GL1來源的結冷膠裂解酶基因在畢赤酵母中進行了表達，構建了重組菌P.pastoris GS115-pPIC9K-nGL1。將重組菌在搖瓶水平誘導表達，獲得最高酶活力為266.4 U/L。進一步在7 L發(fā)酵罐中進行高密度培養(yǎng)，酶活力達954.6 U/L，較搖瓶水平提高了3.58倍。通過分離純化得到結冷膠裂解酶純酶并對其酶學性質展開研究，分析結果表明結冷膠裂解酶的最適反應溫度為45 ℃，當溫度大于45 ℃時酶活力開始迅速下降，在50 ℃以上穩(wěn)定性較差；結冷膠裂解酶在pH 6.0～7.5內酶活力都維持較高的水平，最適反應pH 7.5，在酸性環(huán)境中穩(wěn)定性比較差；Zn2+對酶活力有促進作用，Al3+顯著抑制酶活力。另外，以0.5 g/L結冷膠為底物，通過酶促降解反應生成聚合度為4的結冷膠寡糖，為其工業(yè)制備提供了一種可行性方案。