二胺氧化酶對川味香腸品質及生物胺含量的影響

川味香腸是中國西南地區(qū)知名的傳統發(fā)酵肉制品，因自然發(fā)酵風味濃郁、特點突出而深受消費者喜愛，消費市場和消費潛力巨大[1]。川味香腸高度依賴自然發(fā)酵，在生產過程中極易被微生物污染、易受季節(jié)及氣候等因素影響，使得成品中的生物胺種類多、含量高。生物胺是由氨基酸脫羧酶將肉中游離氨基酸脫羧形成的一類含氮小分子化合物[2]。生物胺是人體生理代謝所需物質，但當機體內的生物胺積累到一定量時就會發(fā)生中毒反應，甚至危及生命[3]。

目前，降低肉制品中生物胺含量的研究主要集中在將具有生物胺氧化酶活性的微生物作為發(fā)酵劑接種到肉制品中，生物胺氧化酶能將已存在的生物胺分解為相應的醛、氨氣和過氧化氫[4]。根據底物氨基個數通?？梢詫⑸锇费趸阜譃閱伟费趸?、二胺氧化酶和多胺氧化酶。單胺氧化酶主要作用于酪胺、苯乙胺[5]；二胺氧化酶通常作用于組胺、尸胺和腐胺[6]；多胺氧化酶主要作用于精胺和亞精胺及腐胺[7]。翟鈺佳[8]篩選到1株具有較強胺氧化酶活性的植物乳桿菌，將其作為發(fā)酵劑添加到羊肉發(fā)酵香腸中，發(fā)現香腸中生物胺含量顯著降低。然而該種方法可能造成輕發(fā)酵食品發(fā)酵過度的情況[9]。黃瑤等[10]通過破碎黑曲霉細胞得到胺氧化酶的粗酶液，添加到自制醬油和市售醬油中，使市售醬油和自制醬油中總生物胺分別降低了69.5%和78.29%。NAILA等[11]在金槍魚魚湯中添加二胺氧化酶，發(fā)現組胺含量顯著降低，在10 h時幾乎降為0。

利用生物胺氧化酶控制生物胺的技術目前主要應用于醬油和水產品中，在肉制品中的應用尚未見報道，并且在復雜的食品基質中添加生物胺氧化酶是否會對食品品質造成影響還有待探究。本研究基于生物胺氧化酶不具有底物特異性的特點[12]，將二胺氧化酶預添加到川味香腸中，探究該酶在川味香腸發(fā)酵、成熟過程中對感官品質以及對生物胺含量的影響，為實際生產中通過外源添加生物胺氧化酶的方式來控制發(fā)酵肉制品中生物胺的含量提供依據和理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮豬肉、腸衣、食鹽、花椒、白酒等調料，四川雅安市雨城區(qū)蒼坪山農貿市場；二胺氧化酶(提取自豬肝臟)，美國Sigma Aldrich公司；MRS培養(yǎng)基等培養(yǎng)基，青島日水生物技術有限公司；組胺、酪胺、腐胺、尸胺標準品、丹磺酰氯等，美國Sigma公司。

1.2 儀器與設備

PHS-3C pH計，杭州奧立龍儀器有限公司；LC-2010CHT高效液相色譜儀，美國Thermo Fisher Scientific 公司；BMS602均質機，德國BRT公司；(ANGGUANG)SC-8全自動色差計，北京康光儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 川味香腸的制作與樣品采集

參照張雪梅[13]的配方，孫霞[14]的工藝流程、參數制作香腸。具體參數如下：

(1)配方：豬肉[m(肥肉)∶m(瘦肉)=3∶7]，食鹽2.8%，白砂糖1%，白酒1.5%，辣椒粉1%，花椒粉0.5%，胡椒粉0.05%，五香粉0.1%，硝酸鹽0.015%，亞硝酸鹽0.007 5%(均為質量分數)，50 mg/kg二胺氧化酶。

(2)工藝流程：原料肉→預處理→添加配料→加酶→攪拌→灌腸→發(fā)酵→成熟→包裝→成品。

(3)工藝參數：發(fā)酵溫度20 ℃，相對濕度85%，時間2 d；成熟溫度13 ℃，成熟相對濕度75%，成熟時間28 d。

實驗取樣：取香腸加工過程中的7個工藝點，即0 d(原料肉)、2 d(發(fā)酵結束)、5 d(成熟第3天)、9 d(成熟第7天)、16 d(成熟第14天)、23 d(成熟第21天)、30 d(成熟結束)進行采樣。

1.3.2 感官品質

1.3.2.1 感官評價

選擇具有一定感官評定經驗的10位品評員，從外觀、組織形態(tài)、風味3個方面進行評價，具體感官評價標準如表1所示。

表1 感官評價標準
Table 1 The table for sensory evaluation standard

1.3.2.2 香氣和滋味的電子鼻、電子舌檢測

電子鼻參照周蘭[15]的方法；電子舌參照張楠[16]的方法。

1.3.2.3 顏色檢測

每組準備14個重復樣品，將樣品切割成1 cm3，測定樣品的L值，a*值、b*值。

1.3.2.4 質構檢測

參照張楠[16]的方法。

1.3.3 生物胺檢測

1.3.3.1 取樣

參照張楠[16]的方法。

1.3.3.2 柱前衍生

參考HUANG等[17]的方法，對樣品中組胺、酪胺、尸胺、腐胺進行柱前衍生。

1.3.3.3 色譜條件

參考HUANG等[17]的方法略作修改。色譜柱為C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流速為0.8 mL/min，紫外檢測器波長為254 nm，進樣量10 μL，柱溫30 ℃，流動相A為超純水，流動相B為色譜級乙腈，采用梯度洗脫程序進行分離：0 min，35%A+65%B；5 min，30%A+70%B；20 min，0%A+100%B；25 min 35%A+65%B，持續(xù)至30 min結束。

1.3.4 數據處理

實驗數據測量3次，所有數據均以平均值±標準差表示，數據分析采用軟件SPSS 27.0，作圖采用軟件Origin 2020進行。

2 結果與分析

2.1 感官品質測定結果

2.1.1 感官分析結果

以外源添加50 mg/kg二胺氧化酶的川味香腸為實驗組，相同條件下未添加二胺氧化酶的為對照組，感官評價結果如表2所示。2組香腸在外觀、組織形態(tài)、風味及總分方面無顯著差異。表明添加二胺氧化酶對川味香腸的感官品質并無影響，這可能是因為2組香腸采用了同樣的原料及加工工藝。

表2 感官評分表 單位：分

Table 2 Results of sensory evaluation

注：相同小寫字母表示差異不顯著

2.1.2 香氣和滋味的電子鼻及電子舌分析結果

電子鼻的反應過程是模擬人體嗅覺形成的過程，而后通過主成分分析將信息進行降維處理。主成分分析貢獻率越大，越能反應更多的指標[18]。從圖1-a可以看出，第1主成分(PC1)與第2主成分(PC2)貢獻率之和為99.988 9%，大于90%，說明這2種主成分能較好的反應原始數據的全部信息。2組香腸在主成分分析圖上有部分重合，加酶組的覆蓋面積相對較大，說明二胺氧化酶能夠在一定程度上增加川味香腸的風味。但2組香腸在電子鼻雷達圖中形成的圖形形狀差異不大(圖1-c)，可能是因為使用相同的配方和加工工藝。與其他4根傳感器相比，2組樣品主要在P30/1及T30/1傳感器上有較明顯的響應，其中傳感器P30/1響應最為顯著，說明其中揮發(fā)性風味物質主要是有機化合物、極性化合物等[19]。

電子舌是模擬人體味覺系統，并能識別出5種基本味道——酸、甜、苦、咸、鮮，可以客觀體現食品滋味[20]。由圖1-b可以看出，PC1與PC2之和為99.796 1%，2組川味香腸滋味較為類似，加酶組所占面積比對照組稍大，說明滋味更加豐富。由電子舌雷達圖1-d可以看出，2組川味香腸在各個傳感器的響應值差距不大，反映出添加二胺氧化酶對香腸的滋味無顯著性影響，呈味物質的組成和含量較為類似，這與感官結果相似。JE、JB、HA、CA、BB探頭響應都較高，說明樣品在酸味、鮮味、咸味方面較為突出，而在苦味上不顯著[21]。

a-電子鼻主成分分析圖；b-電子舌主成分分析圖；c-電子鼻雷達圖；d-電子舌雷達圖
圖1 不同組川味香腸滋味及香氣電子鼻及電子舌分析
Fig.1 Analysis of the taste and aroma of different groups of Sichuan sausages by electronic nose and electronic tongue

2.1.3 質構檢測結果

質構會直接影響產品的感官，受水分含量、離子強度等多因素影響[16]。由表3可知，加酶組在硬度、彈性、黏結性、黏性、咀嚼性及回復性方面與對照組相比均沒有顯著性差異，這說明加酶不會對川味香腸質構產生顯著影響。

2.1.4 色差測定結果

2組香腸的色差檢測結果如表4所示。與對照組相比，香腸成熟結束時加酶組的色差僅在a*值上有顯著性差異。加酶組a*值隨著發(fā)酵和成熟的進行，呈現先下降后上升，最后降低的趨勢?？赡苁且驗榘l(fā)酵過程中原料肉被空氣中的氧氣氧化，顏色變深，隨后亞硝酸鹽、硝酸鹽被原料肉中微生物利用，進行了發(fā)色作用，顏色部分恢復，但隨著產品中水分含量降低，色素濃縮，顏色再次加深，a*值隨之下降，與等[22]研究結果一致。隨著香腸的成熟，加酶組的L值在發(fā)酵和成熟前期相較于原料肉無顯著變化(P>0.05)，僅在成熟末期有顯著性上升(P<0.05)，b*值變化趨勢幾乎一致且無顯著性差異。

表3 兩組川味香腸質構特性
Table 3 Textural characteristics of two groups of Sichuan sausage

注：不同大寫字母表示同行之間差異顯著(下同)

2.2 川味香腸加工過程中生物胺含量的變化

2.2.1 川味香腸加工過程中總生物胺含量的變化情況

川味香腸發(fā)酵、成熟過程中總生物胺含量變化情況如表5所示。隨著香腸加工時間的推進，2組樣品的總生物胺含量不斷升高，表明加酶并不能完全抑制生物胺的積累。與對照組相比，加酶組香腸中總胺含量增長較為緩慢，加酶組總生物胺含量顯著低于對照組，表明添加二胺氧化酶能有效降低生物胺含量及其增長速率。

表4 川味香腸在加工過程中色差的變化
Table 4 Color difference of Sichuan-style sausages during fermentation and ripening

注：不同小寫字母表示同列之間差異顯著(下同)

表5 川味香腸發(fā)酵、成熟過程中總生物胺的變化
Table 5 Changes in the total amount of biogenic amines during the processing of Sichuan sausage

2.2.2 川味香腸加工過程中組胺含量的變化情況

組胺在常見生物胺中毒性最強，過量攝入組胺會引起機體過敏反應，甚至休克，美國食品及藥物管理局(Food and Drug Administration，FDA)對水產品中組胺限定為50 mg/kg。由圖2可知，川味香腸中的組胺含量變化與總生物胺的趨勢一致，對照組中組胺含量剛開始增加較為緩慢，從第9天開始快速增長，這可能是因為成熟溫度、濕度適宜產組氨酸脫羧酶微生物的生長，利用原料肉中蛋白質降解產生的豐富游離組氨酸生成組胺。加酶組中的組胺含量在第30天時增加明顯，達到61.79 mg/kg，略高于FDA限量標準。與張楠[16]接菌生產的川味香腸成熟結束時組胺降解率(30.26%)相比，二胺氧化酶(54.47%)控制組胺效果更顯著。

圖2 兩組川味香腸發(fā)酵、成熟過程中組胺含量的變化
Fig.2 Changes in histamine content during the processing of Sichuan sausages

2.2.3 川味香腸加工過程中酪胺含量的變化情況

酪胺屬于單胺，和組胺一樣是毒性最強的生物胺之一，口服超過100 mg就會出現中毒現象[23]。由圖3可以看出，2組川味香腸在加工過程中酪胺含量不斷升高，但均未超過100 mg/kg，對照組在成熟結束時達到83.4 mg/kg。加酶組在整個加工過程中酪胺含量明顯低于對照組，這說明二胺氧化酶能在一定程度上控制酪胺的含量。加酶組在第2天時酪胺含量增長較為顯著，可能是原料肉中含有豐富的游離酪氨酸、酪胺酸脫羧酶，在適宜條件下產生的；在成熟后期的第23～30天，酪胺增長可能是因為蛋白質進一步降解氧化，產生大量酪氨酸所導致，這與孫霞[14]未加菌發(fā)酵川味香腸檢測結果一致。對比組胺降解情況可以看出二胺氧化酶對于酪胺的控制效果不如組胺強，可能是酪胺是單胺，主要是由單胺氧化酶降解，而二胺氧化酶雖然也能降解，但效果不強。與孫霞等[24]混菌發(fā)酵生產的香腸(38.17%)相比，二胺氧化酶對酪胺的降解率(52.86%)更高。

圖3 兩組川味香腸發(fā)酵、成熟過程中酪胺含量的變化
Fig.3 Changes in tyramine content during the processing of Sichuan sausages

2.2.4 川味香腸加工過程中腐胺含量的變化情況

腐胺是一種二胺，過量的腐胺會產生不良氣味，并抑制人體對組胺的分解，加強組胺的毒性[25]。由圖4可以看出2組川味香腸在整個加工過程中腐胺含量呈上升趨勢。從第5天開始明顯增長，這可能是因為隨著加工的進行，香腸的pH值逐漸降低，肉中產胺微生物為了抵御外界酸環(huán)境開始產生大量生物胺，同時pH值的降低也影響了二胺氧化酶的活性，因而對腐胺的降解速度不及其產生的速度，導致腐胺的積累；在成熟終點加酶組中腐胺含量低于對照組，降解率為6.29%，表明添加二胺氧化酶能降低川味香腸中腐胺含量。

圖4 兩組川味香腸發(fā)酵、成熟過程中腐胺含量的變化
Fig.4 Changes in putrescine content during the processing of Sichuan sausages

2.2.5 川味香腸加工過程中尸胺含量的變化情況

尸胺也是一種二胺，雖然本身毒性不強，但其能與亞硝酸鹽形成強致癌物——N-亞硝胺，還能在一定程度上增強組胺毒性。由圖5可以看出加酶組的尸胺含量隨著加工的進行始終低于對照組，這說明二胺氧化酶對尸胺有較好的控制作用。在加工前5 d，加酶組尸胺含量增加不顯著，一方面可能是原料肉品質較好，尸胺的前體物質游離賴氨酸較少，所產生的尸胺也較少；另一方面，添加的二胺氧化酶能夠分解一部分已生成的尸胺。從第9天起至成熟結束，加酶組尸胺含量出現了顯著性的增長，達到46.07 mg/kg。這可能與香腸成熟中后期環(huán)境變化所導致的二胺氧化酶活性降低有關。在成熟結束時，二胺氧化酶對尸胺降解率達到了43.69%，略低于組胺和酪胺。

圖5 兩組川味香腸發(fā)酵、成熟過程中尸胺含量的變化
Fig.5 Changes in cadaverine content during the processing of Sichuan sausages

綜上所述，添加二胺氧化酶能在香腸發(fā)酵、成熟前期控制其中的生物胺增長速率，但隨著成熟時間的延長，香腸中自身產胺微生物的生長繁殖及其內環(huán)境的變化使得生物胺氧化酶活性受到抑制引起生物胺含量在成熟的中后期不斷積累，含量增高。縱觀本研究中川味香腸的加工過程，二胺氧化酶的添加能有效降低川味香腸加工成熟過程中的生物胺含量，對其中4種主要生物胺的控制能力為組胺>酪胺>尸胺>腐胺。

3 結論

本文通過在川式香腸中加入二胺氧化酶，研究二胺氧化酶對川味香腸感官品質及生物胺含量的影響。結果表明，二胺氧化酶的添加對川味香腸的感官品質無顯著影響，進一步利用電子鼻、電子舌和質構儀檢測香腸的氣味、滋味和質構，結果顯示實驗組和對照組均無顯著差異，但實驗組的紅度值(a*)顯著升高(P<0.05)。二胺氧化酶的添加能顯著降低川味香腸發(fā)酵、成熟過程中總生物胺含量，對4種主要生物胺的抑制情況為組胺>酪胺>尸胺>腐胺，并且添加二胺氧化酶能從發(fā)酵初期就控制生物胺含量，但在后期生物胺含量仍會逐漸增高，故后期研究可以進一步優(yōu)化二胺氧化酶的添加量及香腸的發(fā)酵成熟條件，從而提高二胺氧化酶對生物胺含量的控制。綜上，添加二胺氧化酶不會對川味香腸感官品質產生不良影響，但可顯著的降低川味香腸中生物胺的含量。