海藻酸鈉-瓊脂-蒙脫土固定化菌對(duì)造紙廢水降酚性能的研究

實(shí)驗(yàn)使用的苯酚降解菌株為革蘭氏陰性短粗桿菌Klebsiella pneumoniae ZS01，來(lái)自于本實(shí)驗(yàn)室（-80℃超低溫冷凍儲(chǔ)存冰箱）。

（1）菌株在pH值為7的MPYE培養(yǎng)基中進(jìn)行富集，每升培養(yǎng)基中含有3 g魚(yú)粉蛋白胨，3 g酵母膏，1 g CaCl₂·2H₂O，1.6 g MgCl₂，在恒溫?fù)u床中以150 r/min的轉(zhuǎn)速在35℃下進(jìn)行培養(yǎng)。菌株生長(zhǎng)24 h后，在4℃下以 8000 r/min 的轉(zhuǎn)速離心5 min去除上清液來(lái)收集細(xì)菌。用無(wú)菌水通過(guò)紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)在600 nm下將細(xì)菌濃度調(diào)整到0.8，用于細(xì)菌固定化。

（2）在苯酚降解過(guò)程中，富集菌株在35℃的MedA培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，每升培養(yǎng)基中含有：2 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%天冬氨酸、20 mL pH值為6.8的Solution C溶液（10 g氮川三乙酸，3.33 g CaCl₂，29.5 g MgSO₄·7H₂O，93 mg (NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O，99 mg FeSO₄·7H₂O，50 mL微量元素溶液）、1.25 g L-谷氨酸、10 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)10% NaCl。培養(yǎng)基用1 mol /L KOH和1 mol /L HCl溶液將其pH值調(diào)至7.0~7.3后120℃高溫滅菌30 min，然后用微孔濾膜加入10 mL維生素溶液、20 mL磷酸鹽緩沖溶液（將KH₂PO₄溶液加入到K₂HPO₄溶液中至pH值為6.8）。

（3）苯酚原液的配制：取一定量的苯酚將其配制成6 g/100 mL的苯酚原液并置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/span>

蒙脫土（240 m²/g）、海藻酸鈉、瓊脂和苯酚試劑均購(gòu)自上海阿拉丁生化科技有限公司；其他化學(xué)品均為分析純或色譜純；所有培養(yǎng)基和實(shí)驗(yàn)材料均預(yù)先在120℃下高壓滅菌。

將蒙脫土和瓊脂溶解在去離子水中，混合分散加熱至100℃后，加入海藻酸鈉，不斷加熱攪拌30 min，至水凝膠混合均勻，并且確保水凝膠不含氣泡?；旌暇鶆虻乃z溶液在121℃的高壓滅菌鍋中滅菌30 min，將富集菌株加入至滅菌后冷卻的水凝膠溶液（約40℃）中并充分混合均勻。通過(guò)注射器將均質(zhì)水凝膠溶液滴入滅菌的CaCl₂（4% 質(zhì)量/體積）中，制備直徑約3 mm、質(zhì)量約50 mg的水凝膠珠，于4℃冰箱中固定化12 h。固定的水凝膠珠用0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH值=7.2）至少洗滌3次以去除微球上殘留的鈣離子，制得海藻酸鈉-蒙脫土-瓊脂固定化微球。制備的固定化微球儲(chǔ)存在4℃中以備后用。

為更好地研究固定化微球的降解效果，首先探究了影響固定化微球生物降解苯酚性能的4個(gè)因素。根據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)時(shí)，對(duì)不同影響因素采用一定遞增比例的濃度進(jìn)行批量實(shí)驗(yàn)。將不同濃度的固定化微球和滅菌苯酚加入裝有100 mL滅菌MedA培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，使苯酚濃度達(dá)到1000 mg/L。將所有燒瓶用滅菌封口膜密封以防止苯酚氧化，然后置于35℃、150 r/min的恒溫培養(yǎng)箱中降解。定期收集樣品，并測(cè)量殘留苯酚濃度。

在上述最佳條件下，還研究了固定化微球在苯酚作為唯一碳源時(shí)，苯酚降解性能最優(yōu)時(shí)的苯酚初始濃度。在不同苯酚初始濃度（200、400、600、800、1000 mg/L）條件下，接種相同濃度的游離細(xì)菌作為對(duì)比實(shí)驗(yàn)，將它們與固定化微球的降酚性能進(jìn)行比較。定期收集樣品測(cè)量苯酚的殘留濃度。苯酚降解數(shù)據(jù)用于計(jì)算苯酚降解的比降解速率和降解動(dòng)力學(xué)分析。

圖1(a)為海藻酸鈉微球的表面直觀圖，由圖1(a)可以看出，海藻酸鈉具有很好的成球性，呈透明白色狀。圖1(b)為固定化微球的表面直觀圖，復(fù)合瓊脂和蒙脫土后，微球變?yōu)椴煌该魅榘咨螤钜?guī)則，球體大小均勻。圖1(c)為固定化微球重復(fù)使用5次后的外觀圖，經(jīng)5次循環(huán)后，微球外觀已變成黃色，這是因?yàn)槲⑶騼?nèi)部繁殖生長(zhǎng)出大量的細(xì)菌細(xì)胞，且實(shí)驗(yàn)室細(xì)菌為黃色，因此固定化微球也變成黃色。

圖1  不同材料的形態(tài)

Fig. 1  Appearance of different materials

圖2(a)~圖2(d)為游離細(xì)菌、不同固定材料及固定化微球的橫截面形貌圖。由圖2(a)可以看出，海藻酸鈉微球內(nèi)部包含不規(guī)則的交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)類似于先前研究得出的結(jié)論^[15]。由圖2(b)可以看出，此時(shí)海藻酸鈉-瓊脂-蒙脫土微球內(nèi)部變成了更為緊湊的片狀網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)?？梢?jiàn)瓊脂和蒙脫土與海藻酸鈉交聯(lián)后，微球內(nèi)部孔隙增多，一方面為細(xì)菌的附著和固定提供了更大的比表面積，另一方面也增加了底物的傳質(zhì)效率，也有利于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的傳輸和新陳代謝產(chǎn)物的排出。對(duì)比游離細(xì)菌（圖2(c)）的形貌圖，說(shuō)明固定化微球（圖2(d)）內(nèi)部有大量細(xì)菌成功附著。

  

  

  

  

圖2 不同固定材料及其固定化微球的ESEM圖

Fig. 2 ESEM images of different immobilized materials and immobilized microphere

本研究將海藻酸鈉滴入質(zhì)量分?jǐn)?shù)4% CaCl₂溶液中形成凝膠微球，研究了不同海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)苯酚降解的影響。圖3(a)為海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)苯酚降解速率的影響。由圖3(a)可知，海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的固定化微球苯酚達(dá)到最大降解速率（18.18 mg/（L·h））。隨著海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)增多，固定化微球內(nèi)部比表面積增大，為微生物提供了足夠的吸附、生長(zhǎng)、繁殖的空間，從而提高了微生物傳質(zhì)效率。海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加至1.5%時(shí)，導(dǎo)致固定化微球的苯酚降解速率下降（15.87 mg/（L·h）），說(shuō)明高質(zhì)量分?jǐn)?shù)海藻酸鈉會(huì)使固定化微球內(nèi)部過(guò)飽和，阻礙底物分子通過(guò)微球內(nèi)部擴(kuò)散，降低細(xì)菌對(duì)苯酚的降解速率^[16]。綜上，制備固定化微球海藻酸鈉的最佳質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0%。

  

  

  

  

圖3 影響苯酚降解速率的因素

Fig. 3 Factors affecting the degradation rate of phenol

不同蒙脫土質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)苯酚降解的影響結(jié)果見(jiàn)圖3(b)。由圖3(b)可知，當(dāng)蒙脫土質(zhì)量分?jǐn)?shù)從0增加到1.0%時(shí)，苯酚降解速率緩慢增加。當(dāng)蒙脫土質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5%時(shí)，苯酚降解速率達(dá)最大值17.85 mg/（L·h）。這是因?yàn)槊擅撏量梢晕丈倭勘椒?，減輕苯酚對(duì)細(xì)胞的毒性，為細(xì)菌生存創(chuàng)造良好的微環(huán)境。在固定化微球中加入蒙脫土可以提高其機(jī)械強(qiáng)度、滲透性^[15]。但當(dāng)蒙脫土質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加至2.0%時(shí)，苯酚降解速率與低質(zhì)量分?jǐn)?shù)蒙脫土苯酚降解速率相當(dāng)，約（16 mg/（L·h）），這可能是由于固定化微球中高質(zhì)量分?jǐn)?shù)的蒙脫土堵塞了微球的內(nèi)部孔隙，阻礙了細(xì)菌的生長(zhǎng)和底物的擴(kuò)散，從而抑制了降解細(xì)菌的活性。綜合考慮，固定化微球中蒙脫土的最佳質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5%。

瓊脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)固定化微球降解苯酚性能的影響如圖3(c)所示。由于瓊脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)增高（0.5%、1.0%），固定化微球的片狀網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)增加，固定化微球內(nèi)部平均孔徑增加，機(jī)械強(qiáng)度和穩(wěn)定性也隨之增加，固定化細(xì)菌的數(shù)量也隨之增加，細(xì)菌降解苯酚的速率進(jìn)一步提高，這一結(jié)果在Rehman等人^[17]的研究中也有體現(xiàn)。當(dāng)瓊脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)過(guò)高時(shí)（2.0%），固定化微球內(nèi)部變得更為致密，導(dǎo)致內(nèi)部孔徑減小，也影響了底物擴(kuò)散到固定化微球內(nèi)部的速度，從而降低了苯酚的降解效率。因此，制備固定化微球的最佳瓊脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%。

不同包埋細(xì)菌濃度（體積分?jǐn)?shù)10%~30%）(OD₆₀₀為0.8)對(duì)苯酚降解速率的影響結(jié)果如圖3(d)所示。由圖3(d)可知，隨著細(xì)菌接種量的增加，苯酚的降解速率逐漸增加。細(xì)菌接種量從20%增加至25%時(shí)，苯酚降解速率迅速增加到18 mg/（L·h），這是因?yàn)榧?xì)菌細(xì)胞對(duì)高濃度苯酚的適應(yīng)性逐漸增強(qiáng)，導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞增殖更快，生物降解效率更高。當(dāng)接種量升高至30%時(shí)，降解速率并未顯著提高，大量細(xì)菌在微球內(nèi)部迅速繁殖導(dǎo)致微球過(guò)飽和，此時(shí)不僅影響微球的機(jī)械穩(wěn)定性，也會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌從微球泄露到溶液中，影響后續(xù)循環(huán)降解實(shí)驗(yàn)^[18]。綜合上述因素，制備固定化微球的最佳細(xì)菌接種量為25%。

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用正交實(shí)驗(yàn)考察影響固定化微球各因素之間的交互作用，從而確定最優(yōu)的細(xì)菌固定化條件，正交因素水平如表1所示。

K_i值表示該列因素水平為i時(shí)所對(duì)應(yīng)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果總和，可以判斷某個(gè)因素的最優(yōu)水平和最優(yōu)組合；R值表示某個(gè)因素水平的極差，反應(yīng)某個(gè)因素水平波動(dòng)時(shí)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果的變動(dòng)幅度，R值越大，該因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響越大，可以判斷因素的主次順序。以固定化微球?qū)Ρ椒拥慕到馑俾蕿榭疾熘笜?biāo)，正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示。由表2可知，影響固定化微球?qū)Ρ椒咏到馑俾室蛩氐闹鞔雾樞驗(yàn)椋汉Ｔ逅徕c質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞細(xì)菌接種量＞瓊脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞蒙脫土質(zhì)量分?jǐn)?shù)。正交實(shí)驗(yàn)得出制備固定化微球的最優(yōu)組合為：海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.0%，蒙脫土質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.5%，瓊脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.0%，細(xì)菌接種量25%。在最優(yōu)固定化條件下制備固定化微球，固定化微球可在60 h內(nèi)完全降解1000 mg/L的苯酚，苯酚降解速率為16.67 mg/(L·h)。

重復(fù)使用性是固定化微球的一個(gè)重要考察指標(biāo)，循環(huán)周期中固定化微球苯酚降解速率和細(xì)胞活性見(jiàn)圖7。如圖7(a)所示，在前6個(gè)循環(huán)中苯酚降解速率迅速增加，苯酚降解速率從16.67 mg/（L·h）增加到45.45 mg/（L·h），此時(shí)固定化微球降酚效率處于穩(wěn)定期，降解時(shí)間維持在22 h。由圖7(b)可知，設(shè)定初始細(xì)菌活性為100%，相對(duì)活性以其初始活性的百分比表示，循環(huán)周期中固定化微球的相對(duì)活性與苯酚降解速率的趨勢(shì)是一致的，重復(fù)培養(yǎng)時(shí)細(xì)菌分泌大量胞外聚合物，形成了生物膜，為重復(fù)苯酚降解提供適當(dāng)?shù)沫h(huán)境^[19]。后期降解效率略微下降，這可能是因?yàn)楣潭ɑ⑶蛑屑?xì)菌生物質(zhì)的最大量，限制了底物轉(zhuǎn)移到微球內(nèi)部中。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中觀察發(fā)現(xiàn)，珠粒的形態(tài)基本保持完整的形態(tài)，直到32次循環(huán)結(jié)束，珠子結(jié)構(gòu)完全被破壞，循環(huán)終止。

圖7  循環(huán)周期中固定化微球的苯酚降解速率與細(xì)菌活性

Fig. 7  Degradation rate and cell viability of immobilized micropheres in the cycle

固定化微球的儲(chǔ)存穩(wěn)定性是其是否能被工業(yè)化大規(guī)模應(yīng)用的重要考量因素之一。圖8為固定化微球和游離細(xì)菌的儲(chǔ)存穩(wěn)定性。如圖8所示，隨著儲(chǔ)存時(shí)間的延長(zhǎng)，固定化微球保持穩(wěn)定的苯酚降解率，在4℃下儲(chǔ)存30天后依然可以去除99%的苯酚。微球內(nèi)的細(xì)菌保持生理穩(wěn)定性且微球具有較高的機(jī)械強(qiáng)度。相比之下，游離細(xì)菌的苯酚降解率在超過(guò)15天后急劇下降，甚至在30天后失去活性。以上結(jié)果表明固定化微球具有很強(qiáng)的儲(chǔ)存穩(wěn)定性，可以重復(fù)使用，在實(shí)際應(yīng)用中具有巨大的潛力。

圖8  固定化微球和游離細(xì)菌的儲(chǔ)存穩(wěn)定性

Fig. 8  Storage stability of immobilized micropheres and free bacteria